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Oct 03, 2023

Las contribuciones de las bacterias oxidantes de amoníaco y las arqueas a la nitrificación

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 19928 (2022) Citar este artículo

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Se cree que la nitrificación es uno de los principales procesos de emisión de N2O en el sistema agroecológico, que está controlado por los microbios del suelo y principalmente regulado por el pH del suelo, el contenido de oxígeno y la disponibilidad de NH4+. Estudios previos han demostrado que las contribuciones relativas de las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) y las arqueas (AOA) a la producción de N2O variaron con el pH del suelo; sin embargo, todavía no hay consenso sobre el mecanismo regulador de la producción de N2O derivado de la nitrificación por el pH del suelo. En este estudio, se utilizaron 1-octino (un inhibidor selectivo de AOB) y acetileno (un inhibidor de AOB y AOA) en un experimento de incubación de microcosmos para diferenciar la contribución relativa de AOA y AOB a las emisiones de N2O en un ambiente neutro (pH = 6,75). ) y un suelo alcalino (pH = 8,35). Descubrimos que la enmienda de amonio (NH4+) estimuló de manera observable la producción de N2O relacionado con AOA y AOB y aumentó la abundancia de genes de amoníaco monooxigenasa (AMO) de AOA y AOB en los dos suelos de prueba. Entre los cuales, el AOB dominó el proceso de oxidación del amoníaco en el suelo alcalino, aportando el 70,8% de la producción de N2O derivado de la nitrificación. Por el contrario, la contribución de AOA y AOB representó aproximadamente un tercio del N2O relacionado con la nitrificación en suelos ácidos, respectivamente. Los resultados indicaron que el pH fue un factor clave para cambiar la abundancia y actividad de AOA y AOB, lo que condujo a la diferenciación de la derivación de la producción de N2O en suelos morados. Especulamos que tanto el contenido de NH4+ como el pH del suelo mediaron la especialización de los microorganismos oxidantes de amoníaco juntos; y tanto los resultados de la especialización como el rendimiento de N2O llevaron a las diferentes características de emisión de N2O en los suelos morados. Estos resultados pueden ayudar a informar el desarrollo de estrategias de reducción de N2O en el futuro.

El N2O es un gas de efecto invernadero con 265 veces el potencial de calentamiento del CO2 (en una escala de 100 años) en la atmósfera y actúa para agotar el ozono estratosférico1. La concentración global de N2O en la atmósfera fue de 328,8 ppb en 2015 con un aumento del 21 % desde la revolución industrial2. Las emisiones sostenidas al ritmo actual resultarán en un aumento de otro 18% hasta 2030 con respecto a las proyecciones actuales indican3. El suelo agrícola fertilizado es un punto crítico para las emisiones sustanciales de N2O a la atmósfera, lo que representa aproximadamente el 60 % de las emisiones globales de N2O atmosférico4. Sin embargo, la creciente demanda de alimentos, cría de animales y energía de biomasa inevitablemente acompañará a la aplicación continua de fertilizantes químicos. Por lo tanto, es particularmente importante comprender el mecanismo responsable de la producción de N2O a partir del suelo fertilizado para encontrar medidas óptimas para regular las emisiones de N2O para una agricultura sostenible.

En los agroecosistemas, el N2O se produce por nitrificación y desnitrificación impulsada por microorganismos del suelo5,6, y algunos procesos abióticos también contribuyen con una pequeña parte7. La nitrificación es un proceso principal de producción de N2O bajo un contenido adecuado de oxígeno en el suelo. La oxidación del amoníaco (es decir, NH3 que se oxida a NO2−, a través del producto intermedio NH2OH) se considera el paso principal y limitante de la velocidad de la nitrificación. Tanto las arqueas oxidantes de amoníaco (AOA) como las bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) tienen el potencial genético para la oxidación de amoníaco que provoca la producción de N2O8,9. AOB podría producir N2O que actúa como intermediario por la oxidación incompleta de NH2OH a NO10, o mediante la regulación de la desnitrificación del nitrificante de la reducción de NO2− a NO y N2O11. Por el contrario, el N2O producido por AOA se atribuye a múltiples procesos detectados convencionalmente en cultivos puros y enriquecidos, pero hasta la fecha no había pruebas claras que respaldaran la producción de N2O por reacción catalítica enzimática de AOA en suelos12. Además, los oxidantes de amoníaco completos (comammox) recientemente descubiertos y generalizados, que actúan como uno de los gremios funcionales de oxidación de amoníaco, constituyen una incertidumbre sobre la influencia en la emisión de N2O, aunque algunos estudios sugirieron que desempeña un papel menor que AOB13,14.

Los inhibidores de la nitrificación se han aplicado ampliamente en suelos agrícolas para reducir la transformación de NH4+-N en NO3–N, mejorando así la eficiencia en el uso de N15. Una de las enzimas funcionales clave en los oxidantes de amoníaco AOA y AOB es la monooxigenasa de amoníaco (AMO), que catalizó directamente el proceso de síntesis de N2O. El acetileno (C2H2) es un inhibidor de la nitrificación no selectivo para AMO, lo que inhibe la oxidación de amoníaco tanto de AOA como de AOB a una concentración baja (0,1–10 Pa)16,17. Mientras tanto, el 1-octino es un inhibidor selectivo que puede inhibir la actividad AOB pero no la AOA en suelos, y puede usarse para distinguir la contribución relativa de AOB y AOA a la nitrificación18,19,20,21.

Estudios sustanciales han encontrado que muchos factores, incluidos los tipos de suelo y los factores ambientales, determinan la abundancia, las actividades y la contribución relativa a la emisión de N2O de AOA y AOB, especialmente el pH del suelo y el suministro de nitrógeno (N) inorgánico22,23,24. Por ejemplo, la abundancia y actividad de AOB aumentó en suelos ricos en concentración de amonio, mientras que los AOA no se vieron afectados ni inhibidos16,18. En suelos ácidos o sin fertilizar, la abundancia y actividad de AOA son mucho más altas que las de AOB25,26. Wang et al.21 informaron que las emisiones de N2O inducidas por fertilizantes nitrogenados se atribuyen 70.5 ~ 78.1% por AOB y 18.7 ~ 19.7% por AOA usando el método de inhibidores tanto en suelos cultivables ácidos (pH = 6) como alcalinos (pH = 8). de China. De manera similar, usando el método de los inhibidores, Yang et al.27 encontraron que AOB era el actor microbiano clave en suelos alcalinos que aportaba alrededor del 85 % del N2O relacionado con la nitrificación, mientras que el AOA contribuía con el 78 % del N2O relacionado con la nitrificación en suelos ácidos. . Además, la contribución relativa de AOB y AOA a las emisiones de N2O también se reguló por el tipo y la cantidad de sintético aplicado. Hink et al.24 encontraron que la alta adición de amoníaco estimulaba la producción de N2O a partir de AOB, pero el dominio de AOA durante el bajo suministro de amonio. Sin embargo, Fu et al.28 ilustraron que la contribución relativa de AOB a las emisiones de N2O en el tratamiento sin aplicación de N fue mayor que el tratamiento con adición de N y amonio tanto en suelos ácidos (pH = 5,5) como alcalinos (pH = 7,9) y tratamiento de adición de urea-N en suelos alcalinos.

Numerosos estudios han investigado la contribución relativa y los factores de influencia de AOA y AOB en la emisión de N2O, pero no existe consenso con respecto a los mecanismos para explicar las diversidades debido al complejo mecanismo de cambio de abundancia y rendimientos de N2O de AOA y AOB acompañados de heterogeneidad espacial y temporal de condiciones ambientales y propiedades del suelo. Debido a la considerable fuente de emisión de N2O causada por la aplicación intensa de fertilizantes nitrogenados en tierras de cultivo en suelo púrpura en la zona montañosa de la cuenca del río Yangtze superior29,30, es imperativo proponer medidas específicas para aliviar las emisiones de N2O para lograr el objetivo estratégico de " reducción de carbono" en esta región. Por lo tanto, llevamos a cabo un experimento de incubación de microcosmos con dos suelos púrpuras contrastantes, utilizando el inhibidor 1-octino y el método de biología molecular recientemente desarrollados para evaluar los factores que afectan la producción de N2O, el rendimiento y la abundancia de genes asociados con AOA y AOB en diferentes suelos. El objetivo es adquirir una comprensión más profunda del mecanismo del proceso de oxidación del amoníaco y promover el desarrollo de tecnología de bajas emisiones en la agricultura.

En septiembre de 2020, se recolectaron dos muestras de suelo superficial de prueba de parcelas experimentales de fertilización a largo plazo (5 m × 1,5 m, parcelas triplicadas de cada suelo de prueba) en la Estación Agroecológica de Suelo Púrpura de Yanting, Academia de Ciencias de China (N 31 ° 16 ′, E 105 ° 28 ′), ubicado en la cuenca central de Sichuan, río Yangtze superior, China. La temperatura promedio fue de 17.3 °C y la precipitación media anual fue de 863 mm de los cuales aproximadamente el 70% se presenta de mayo a septiembre en este sitio. El sistema de cultivo es una rotación de maíz de verano-trigo de invierno y se aplicó N–P2O5–K2O a 150–90–36 kg ha−1 para el maíz y 130–90–36 kg ha−1 para el trigo, respectivamente.

Se formularon dos suelos de prueba que incluyen uno neutro (pH = 6,75 y denominado SX a continuación) y uno alcalino (pH = 8,35 y denominado PL a continuación) a partir de un lecho rocoso parental similar de arenisca purpúrea con diferente grado de meteorización y tiene menos de 50 años. desde la formación de los suelos31,32. Son los tipos de suelo predominantes en las áreas montañosas de la cuenca del río Yangtze Superior, donde era una importante zona productora de cereales en el suroeste de China y alimentaba a más del 10 % de la población china.

Se recogieron dos suelos superficiales de prueba (0-15 cm) usando una barrena de suelo y núcleos por triplicado, que estaban a lo largo de la línea central longitudinal de las parcelas con un intervalo de dos metros, se agruparon y homogeneizaron para cada parcela. Todos los suelos se tamizaron a través de un tamiz de 2 mm después de eliminar las raíces de las plantas y los desechos y luego se dividieron en dos partes. Una parte se usó para medir el contenido de agua del suelo y las propiedades físicas y químicas básicas, la parte restante del suelo se almacenó a 4 °C hasta el experimento de incubación. Algunas propiedades físicas y químicas básicas de los dos suelos se muestran en la Tabla 1.

Para distinguir la contribución relativa de los diferentes procesos de oxidación de amoníaco a la emisión de N2O, empleamos acetileno y 1-octino como inhibidores selectivos para bloquear la interacción de los oxidantes de amoníaco (es decir, AOB y AOA). Los experimentos de incubación se realizaron en frascos de suero de 250 ml con tapón de goma de butilo que contenían 18 g de suelo (peso seco). Los suelos frescos se preincubaron a 25 °C durante 7 días para estabilizar las actividades microbianas del suelo en botellas de suero de 250 ml. Después de la incubación previa, el suelo se ajustó al 60 % de WFPS después de la enmienda con agua esterilizada únicamente (control, sin adición de N) o solución de nitrógeno inorgánico (100 mg NH4Cl-N o KNO3-N g-1 de suelo en peso). Luego, las botellas se cubrieron con tapas y parte del aire bombeado se reemplazó con inhibidores del oxidante de amoníaco preparados previamente, acetileno (Ace, 0.01%, v/v) o 1-octino (Oct, 5 μM acuoso, siguiendo a Taylor et al.20 ). En total, se realizaron nueve tratamientos con tres repeticiones de la siguiente manera:

Libre de N (sin N ni inhibidores)

N-libre + Ace (sin N y 0,01% de acetileno)

N-libre + Oct (sin N y 5 μM 1-octino)

NH4+ (100 mg g−1 NH4Cl-N y sin inhibidores)

NH4+ + Ace (100 mg g−1 NH4Cl-N y 0,01% acetileno)

NH4+ + Oct (100 mg g−1 NH4Cl-N y 1-octino 5 μM)

NO3− (100 mg g−1 KNO3-N y sin inhibidores)

NO3− + Ace (100 mg g−1 KNO3-N y 0,01% acetileno)

NO3− + Oct (100 mg g−1 KNO3-N y 5 μM 1-octino)

Todos los tratamientos se realizaron a 25 °C durante 21 días. Durante este período, las condiciones óxicas se mantuvieron aireando cada 2 días y restableciendo el ambiente de inhibición mediante la adición de acetileno (0.01% v/v) y 1-octino (5 μM acuoso). La emisión de N2O de suelos sin inhibidores fue contribuida por nitrificación (incluyendo contribuciones de AOB y AOA), desnitrificación y procesos abióticos. El acetileno podría inhibir la oxidación de amoníaco tanto de AOA como de AOB, por lo que la emisión de N2O de AOA más AOB se calculó restando la emisión de N2O en el tratamiento "NH4+ + Ace" ("NO3− + Ace" o "Ace") de los valores medidos en el Tratamiento "NH4+" ("NO3−" o "N-libre"). Debido a que el 1-octino inhibe específicamente el crecimiento de AOB únicamente, la emisión de N2O del AOA se calculó restando la emisión de N2O en el tratamiento "NH4+ + Ace" ("NO3− + Ace" o "Ace") de los valores medidos en el tratamiento "NH4+ + Oct" ("NO3− + Oct" u "Oct"). La emisión de N2O de AOB se calculó restando AOA de los valores de AOA más AOB.

Las muestras de gas headspace de 20 ml se recogieron a los 0, 1, 2, 3, 5, 7, 11, 14, 18 y 21 días mediante jeringa (con válvula triple) durante toda la incubación y se determinó el concentrado de emisión de N2O con un gas cromatógrafo equipado con un detector de captura de electrones 63Ni para concentraciones de N2O (Agilent 7890B, EE. UU.). La medición de gas se calibró utilizando una concentración conocida de gas mixto (440 ppb de N2O en gas estándar mixto). Los suelos incubados fueron muestreados destructivamente a los 0, 7, 14 y 21 días. Las muestras de suelo se dividieron en dos partes, una parte se almacenó a 4 °C para medir el contenido del suelo de NH4+-N y NO3−-N; y otra porción se mantuvo a -80 °C para la extracción de ADN. Los contenidos del suelo de NH4+-N y NO3–N se extrajeron con una solución de KCl 2 M (suelo: solución = 1:5 p/v), y luego se filtraron a través de una membrana de filtro de 0,45 m después de agitar durante 1 h. Los extractos se analizaron mediante un analizador de flujo continuo (Auto Analyzer 3, SEAL Analytical, Alemania).

Las muestras de suelo recogidas antes de la incubación y después de 21 días de incubación se utilizaron para extraer ADN porque los flujos de emisión de N2O se han estabilizado después de 21 días de incubación. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se utilizaron 0,5 g de suelo húmedo para extraer el ADN utilizando el kit de aislamiento de ADN DNeasy PowerSoil (QIAGEN, Alemania). La longitud del ADN extraído se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% y la concentración y calificación se midieron con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Nano Drop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.). Y la proporción de A260/280 y A260/230 estuvo en el rango de 1,5–1,9 y 0,7–1,0, respectivamente. Las concentraciones de ADN purificado variaron de 10,8 a 36,8 ng/μl. Las muestras de ADN del suelo se almacenaron a -80 °C para PCR cuantitativa de análisis de genes amoA.

Los genes AOB y AOA amoA de todos los tratamientos con tres réplicas biológicas se amplificaron y cuantificaron usando PCR de fluorescencia cuantitativa en tiempo real ABI 9700 (Applied Biosystem, América); La secuencia de los cebadores amplificados AOB amoA fue amoA-1F (5'-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3')/amoA-2R (5'-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3')33 mientras que ArchamoAF (5'-TAATGGTCTGGCTTAGACG-3')/ArchamoAR (5' -GCGGCCATCCATCTGTATGT-3')34 para amplificar y cuantificar el gen AOA amoA. Cada sistema de reacción de 20 μl contenía 10 μl de GoTaq qPCR Master Mix (SYBR Premix Ex TaqTM), 0,5 μl de cada cebador (10 mM), 2 μl de molde de ADN diluido diez veces y 7 μl de agua pura esterilizada. Las condiciones de reacción amplificadas de AOB y AOA fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 95 °C por 3 min, 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 30 s, hibridación a 55 °C por 34 s y extensión a 72 °C por 32 s, y extensión a 72 °C durante 5 min para la toma de datos. Las curvas estándar que se utilizaron para cuantificar la abundancia del gen amoA de AOA y AOB se obtuvieron diluyendo en serie diez veces el ADN del plásmido AOA y AOB con una concentración conocida (cinco puntos de 10–3 ~ 10–7 en este estudio). Los análisis de la curva de fusión que se usaron para verificar la especificidad de los productos de amplificación mostraron que las eficiencias de amplificación de AOB y AOA amoA oscilaron entre 92 y 98 %, junto con el coeficiente de correlación (R2) de las curvas estándar fue 0,994 y 0,998 para los genes AOB y AOA amoA , respectivamente.

Los flujos de N2O se calcularon utilizando la ecuación. (1):

donde F (ng N g−1 d−1) es la tasa de emisión de N2O; T0 (237 K) es la temperatura en el estado atmosférico estándar; T (°C) es la temperatura del aire dentro de las botellas de suero; V (L) es el volumen del espacio de cabeza; V0 (22,41 × 10–3 m3) es el volumen molar en el estado atmosférico estándar; M (28 g mol−1) es el peso molecular de N en N2O molecular; m (18 g) es el peso del suelo secado al horno en las botellas de suero; dc/dt es el cambio de concentración de N2O (c) por unidad de intervalo (t); 24 es el número de horas en un día y K es el coeficiente de conversión dimensional.

Las contribuciones relativas de AOA y AOB a la emisión de N2O impulsada por la nitrificación se calcularon usando las Ecs. (2) ~ (4):

donde "total de emisión de N2O" fue la producción acumulada de N2O del tratamiento sin adición de inhibidores después de 21 días de incubación; La "emisión de N2O por otros" fue la producción acumulada de N2O de otros procesos después de 21 días de incubación.

El rendimiento de N2O para AOA, AOB y otros se calculó utilizando la ecuación. (5):

donde x es AOA, AOB y otros, "emisión de N2O (x)" y "NO3− producido" son el N2O y el nitrato acumulados durante los 21 días completos de incubación, la unidad de "emisión de N2O (x)" y "NO3– N producido" es mg N kg−1.

El análisis estadístico se realizó con el software SPSS 24.0 (SPSS Inc., EE. UU.) y los datos de este estudio se expresaron como media ± error estándar. Las diferencias entre diferentes tratamientos se probaron mediante ANOVA después de la prueba de rango múltiple de Tukey por la diferencia menos significativa al nivel del 5%. Se realizó una prueba t para muestras independientes para el análisis estadístico del rendimiento de N2O entre dos suelos. Se calculó la correlación de Pearson entre las emisiones acumulativas de N2O y las copias del gen AOB o AOA amoA. Las figuras se realizaron utilizando el software Origin 9.4 (Origin Lab Corporation, Northampton, EE. UU.).

La concentración de NH4+-N intercambiable del tratamiento “NH4+” disminuyó rápidamente de un valor de 104 mg/kg a un valor de 41 mg/kg y de 107 mg/kg a 31 mg/kg en suelo SX y PL en la primera semana, respectivamente. Y la tasa de disminución se volvió lenta en las siguientes dos semanas (Fig. 1a2, b2). En contraste con el tratamiento "NH4+", el 1-octino inhibió la disminución de la concentración de NH4+–N intercambiable de manera efectiva, lo que mostró una tasa de disminución más lenta en ambos suelos. En cuanto a los tratamientos "NH4+ + Ace", la conversión de NH4+ se inhibió por completo y no se detectó una tendencia decreciente evidente. Los tratamientos sin adición de NH4+ mantuvieron un nivel bajo de concentración de NH4+-N intercambiable durante toda la incubación, y no hubo diferencias significativas en estos tratamientos, ya sea que se aplicaran inhibidores o no (P > 0.05; Fig. 1a1, a3, b1, b3).

Las concentraciones de NO3–N intercambiables aumentaron correspondientemente por la disminución de las concentraciones de NH4+-N intercambiable en los tratamientos "NH4+" (Fig. 1c2, d2). Como era de esperar, el 1-octino presente inhibió parcialmente la formación de NO3–N intercambiable en los tratamientos "NH4+ + Oct" y el acetileno inhibió casi por completo la transformación de NH4+-N a NO3–N en los tratamientos "NH4+ + Ace" en los dos suelos. En cuanto a los tratamientos sin adición de NH4+, no hay una diferencia obvia independientemente de que se aplicaran o no los inhibidores (P > 0.05; Fig. 1c1, c3, d1, d3).

Las tendencias de cambio de los flujos de N2O variaron según el tipo de suelo. Los tratamientos que agregaron NH4+ solo mostraron un pico de N2O distinto (7 y 33 ng N g−1d−1 para suelo experimental SX y PL, respectivamente) en el primer día de incubación, y disminuyeron rápidamente en los días siguientes (Fig. 2a2, b2). La adición de acetileno tiene un efecto significativo en la disminución de la producción de N2O en el tratamiento "NH4+ + Ace" de los dos suelos a lo largo de toda la incubación, lo que indica que AOA más AOB contribuyen con más emisiones de N2O que los procesos abióticos y de desnitrificación en condiciones experimentales aeróbicas y 60% WFPS . En relación con la adición de acetileno, el 1-octino tiene una inhibición similar pero más leve de las emisiones de N2O en el "NH4+ + Oct" de los dos suelos, lo que demuestra que diferentes inhibidores de la nitrificación tuvieron efectos inhibidores selectivos en el alivio de las emisiones de N2O como se esperaba (Fig. 2a2 , b2). A excepción de los tratamientos de adición de NH4+, los resultados también revelan que los tratamientos con o sin NO3–N no muestran diferencias significativas en las emisiones de N2O sin importar los inhibidores presentes o no durante el período de incubación de 21 días (P > 0.05). Y no hay picos de emisión en estos tratamientos sin adición de NH4+ y los flujos muestran una fluctuación periódica hasta el final de la incubación (Fig. 2a1, a3, b1, b3).

Las emisiones acumuladas de N2O variaron según el tipo de suelo, los tipos de fertilizante nitrogenado y los inhibidores (Fig. 2c1 ~ c3, d1 ~ d3). En los tratamientos "NH4+", la emisión acumulada de N2O fue significativamente mayor que el resto de los tratamientos, alcanzando 14 y 45 μg N kg−1 de suelo seco para el suelo del experimento SX y PL al final de la incubación, respectivamente (P < 0.05; Tabla S1) . Cuando se empleó la adición de NH4+ con 1-octino, las emisiones acumuladas de N2O se redujeron drásticamente en un 24,1 % y un 72,0 % para el suelo experimental SX y PL, respectivamente, y la inhibición más intensa por la adición de acetileno se redujo en un 80,3 % y un 92,4 % en relación a los tratamientos "NH4+". En cuanto a los tratamientos con adición de NO3− y sin adición de fertilizante nitrogenado, con o sin inhibidor, no hubo diferencias significativas para los dos suelos de prueba al final de la incubación (P > 0,05; Tabla S1).

El rendimiento de N2O (%) se definió como la tasa de producción de N2O por unidad de contenido de nitrato en el suelo durante los 21 días completos de incubación, que se calculó mediante la ecuación. (5). Los resultados mostraron que el rendimiento de N2O en diferentes procesos de oxidación de amoníaco cambió con el tipo de suelo bajo la condición de agregar NH4+ (Fig. 3). El rendimiento de N2O de AOB en suelo PL fue de 0,22 %, que fue significativamente mayor que el de SX (0,03 %) (P < 0,01), y se encontraron diferencias significativas similares en los rendimientos de N2O inducidos por AOA (P < 0,05). Sin embargo, para otros procesos (inducidos por abióticos o inducidos por desnitrificación), el rendimiento de N2O del suelo SX fue significativamente mayor que el del suelo PL (P < 0,05). Bajo las mismas condiciones de suelo con adición de NH4+, el rendimiento de N2O cambió con diferentes procesos de inducción: en suelos PL, el rendimiento de N2O inducido por AOB fue significativamente mayor que el inducido por AOA y los otros procesos (P < 0.01); Pero en suelos SX, el rendimiento de N2O inducido por otros procesos fue significativamente mayor que el inducido por AOA y AOB (P < 0,01).

La contribución relativa de AOA y AOB a la producción de N2O varió significativamente de los tipos de suelo con enmienda NH4+ en ambos suelos (Fig. 4). Las fracciones de producción acumulada de N2O de octino-sensible (AOB) fueron mucho más altas que las de octino-resistente (AOA) en los suelos PL. Y para suelo SX, la fracción de producción AOB fue ligeramente superior a la AOA y las demás. En detalle, las fracciones de emisión de N2O fueron 36,1%, 33,2% y 30,7% para AOB, AOA y otros procesos en suelo SX, respectivamente. Las contribuciones de AOB, AOA y otros relevantes son 70.8%, 21.4% y 8.9% en suelo PL, respectivamente.

Al comienzo de la incubación, la abundancia de genes AOB amoA fue de 1,65 × 105 y 1,62 × 106 copias g-1 de suelo seco en suelo SX y PL, respectivamente (Fig. 5a, b) y los diferentes tratamientos tienen la misma abundancia al inicio de la incubación. incubación. La enmienda NH4+ estimuló significativamente el aumento de los genes AOB amoA, alcanzando 3.38 × 105 y 3.58 × 106 copias g−1 en suelo SX y PL en el día 21 de incubación, respectivamente (P < 0.01; Fig. 5a, b) . No hay una diferencia obvia de la abundancia de genes AOB amoA entre los otros tratamientos a lo largo de la incubación, independientemente de si se aplicaron o no fertilizantes nitrogenados e inhibidores en ambos suelos.

En cuanto a los genes AOA amoA, la abundancia de genes AOA amoA fue de 1,23 × 107 copias g-1 y 8,35 × 106 copias g-1 de suelo seco en suelo SX y PL al inicio de la incubación, respectivamente. Cuando se corrigió con amoníaco y 1-octino, la abundancia de genes AOA amoA aumentó de manera observable que con los otros tratamientos en los dos suelos (P < 0.01; Fig. 5c, d). La presencia de 1-octino que se seleccionó como inhibidor de AOB no mostró una supresión efectiva del crecimiento de los genes AOB amoA, por el contrario, actuó como un estímulo positivo para la abundancia de genes AOA amoA en los dos suelos de prueba. Los tratamientos con agua o enmienda de NO3 que se aplicaron con inhibidores o sin inhibidores no cambiaron significativamente la abundancia de genes AOA amoA durante toda la incubación (P > 0.05).

Los procesos abióticos y los procesos bióticos, incluida la nitrificación y la desnitrificación, se consideran procesos primarios que producen N2O en suelos cultivables según numerosos informes7,35,36. Esto es primero para distinguir la contribución relativa de la oxidación de amoníaco y el rendimiento de N2O resultante de AOA y AOB en diferentes pH de suelo púrpura, suroeste de China, usando 1-octino para inhibir específicamente AOB. En este estudio, verificamos que las emisiones de N2O de los dos suelos agrícolas probados fueron impulsadas por la nitrificación y otros procesos no despreciables en función de los siguientes puntos: (1) NH4+-N se transformó rápidamente en NO3–N en los tratamientos de adición de NH4+-N y dio como resultado una producción de N2O mucho mayor que los tratamientos de adición de NO3-N en los que el NO3-N permaneció estable durante la incubación (Fig. 1); (2) ambos suelos de prueba se realizaron en condiciones aeróbicas y con un 60 % de WFPS, que son una producción óptima de N2O a través de la oxidación de amoníaco según estudios previos6. Y las emisiones de N2O de los desnitrificadores heterótrofos fueron insignificantes24; (3) Sin embargo, el N2O se acumuló lentamente pero no desdeñable en los microcosmos tratados con acetileno cuando el oxidante de NH3, incluidos el crecimiento y la actividad de AOA y AOB, se inhibieron, lo que indica que la emisión de N2O inducida por otros procesos (nitrificación heterótrofa y procesos abióticos, etc.) también tiene un efecto asignable. contribución, especialmente en los suelos neutros donde otros procesos contribuyen en un 30,7% a la emisión bruta de N2O en la incubación (Tabla S1 y Fig. 4).

La dinámica del contenido de NH4+-N (a1 ~ a3, b1 ~ b3) y el contenido de NO3−–N (c1 ~ c3, d1 ~ d3) con diferentes fertilizantes de N (sin N, N-amonio, N-nitrato) en combinación con aire (sin inhibidores), acetileno y 1-octino durante la incubación de suelo SX y PL, las barras de error representan errores estándar de tres réplicas biológicas.

Numerosos estudios han confirmado que las emisiones de N2O en los suelos cultivables estaban reguladas por múltiples factores ambientales, como la humedad del suelo, el pH del suelo y factores de gestión, incluida la aplicación de N, el arado y otros tratamientos de gestión del suelo37,38,39. El pH del suelo es un parámetro clave que controla el cambio de abundancia de AOA y AOB que influyen en la producción de N2O40. En nuestro estudio, AOB contribuyó con más emisiones de N2O acumuladas que AOA en suelos alcalinos en la condición de adición de NH4+-N, lo que indicó que AOB dominó el proceso de nitración en suelos alcalinos, mientras que no se observó una diferencia significativa en suelos neutros donde tanto AOA como AOB contribuyeron casi un tercio de las emisiones brutas de N2O (Fig. 4 y Tabla S1). Descubrimos que AOB jugó un papel más importante que AOA en la oxidación de amoníaco en un suelo de pH alto, lo que respalda informes anteriores21,22,41,42. Una posible explicación es que los suelos con un pH más alto aceleran la tasa de transformación de NH4+–N en NH3 disponible, lo que afectó la población y la actividad de los oxidantes de amoníaco27, mientras que el crecimiento bacteriano posiblemente se habría visto impedido en un suelo con un pH bajo43.

Claramente, los suelos probados con NH4+ estimularon la producción de N2O tanto por AOA como por AOB en diversos grados con respecto al control (Fig. 2 y Tabla S1). Y estos resultados también fueron confirmados por el marcado aumento de la abundancia del gen amoA de AOA y AOB al final de la incubación (Fig. 5). Actualmente, la mejor explicación para el diferente crecimiento y actividades de AOA y AOB en suelos es una afinidad significativamente diferente por NH344,45,46. Por ejemplo, los suelos con alto contenido de NH4+-N conducen al crecimiento de AOB16,20, mientras que la actividad de AOA, que se ve favorecida por un suelo con bajo contenido de NH4+-N, puede verse restringida o no verse afectada en esta condición de alto contenido de NH4+-N 47,48. En nuestro estudio, la abundancia de amoA de AOA en el control de dos suelos de prueba aumentó, pero no significativamente, lo que indica que AOA podría crecer usando N orgánico en suelos con bajo estado de fertilidad de amoníaco22,49. Inesperadamente, encontramos que AOA también creció en esta condición donde la alta concentración de NH4+-N y AOB fue inhibida por 1-octino porque el aumento significativo de la abundancia de amoA de AOA demostró este punto que era diferente de varios estudios previos (Fig. 5c, d) 21,28. Y este resultado estaba en línea con un informe reciente de que había una competencia directa entre AOA y AOB por NH3 bajo una alta concentración de NH4+-N cuando AOB era inhibido por 1-octino, mientras que el crecimiento de AOA continuaba y el crecimiento de AOB cesaba cuando NH4+-N se convertía en indetectable24,50.

Los flujos de emisión de N2O y los flujos acumulados con diferentes fertilizantes de N (N-libre, N-amonio, N-nitrato) en combinación con aire (sin inhibidores), acetileno y 1-octino después de 21 días de incubación en SX (a y c) y PL (b y d) suelo, las barras de error representan errores estándar de tres réplicas biológicas.

Cuando se suministró NH4+–N como fertilizante, el AOB dominó el proceso de oxidación de NH3 y el rendimiento de N2O osciló entre 0,03 y 0,22 %, lo que varió según el tipo de suelo (Fig. 3). En suelo neutro, el rendimiento de N2O inducido por AOB (~ 0,03 %) cayó dentro del rango de valores (0,02–0,09 %) que se derivaron de lodos de suelo con NH4+ experimento modificado51. Mientras que en suelo alcalino, el mayor rendimiento de N2O de AOB (0,22%) es similar a los resultados del cultivo puro del linaje Nitrosospira del suelo52 que predomina en las comunidades AOB del suelo53. En cuanto a AOA, cuando se agrega NH4+–N, el rendimiento de N2O es de 0,02 % ~ 0,04 % en los dos suelos de prueba, y estos rendimientos son similares a los valores de 0,035 % informados previamente por Hink et al.50 y ligeramente inferiores a los de los suelos cultivados. suelo AOA (0.08% ~ 0.23%)12,54,55. Estos resultados sugirieron que AOB podría tener un mayor rendimiento de N2O que AOA en el proceso de producción de N2O tanto en suelos alcalinos como neutros. El mayor rendimiento de N2O para AOB que para AOA podría explicarse por el reconocimiento actual: había dos mecanismos enzimáticos para la producción de N2O en AOB (es decir, desnitrificación con nitrificador y oxidación incompleta de NH2OH), mientras que AOA parecía carecer de una NO reductasa conocida, que era una enzima clave. de reducir el NO a N2O56,57,58. Por lo tanto, la producción de N2O de AOB se conocía como un proceso biótico, mientras que la inducción por AOA parecía más una formación de híbridos bióticos y abióticos59.

El rendimiento de N2O asociado con la oxidación de amoníaco en tratamientos modificados con NH4+; Las letras diferentes sobre las barras indican una diferencia significativa y las mismas letras indican que no hay diferencia significativa y las barras de error representan los errores estándar de tres réplicas biológicas.

Además, el método de adición de inhibidores de nitrificación tiene limitaciones en la efectividad para distinguir la emisión relativa de N2O de AOA y AOB21. El 1-octino es un inhibidor selectivo eficaz de la actividad de AOB y la abundancia de amoA en los suelos de prueba, y descubrimos que AOB tiene el papel principal en la producción de N2O del suelo en los tratamientos de adición de NH4+-N, aunque la abundancia de amoA de AOA muestra varias veces la de AOB en ambos. suelos (Figs. 4 y 5). El acetileno actuó como un inhibidor no selectivo que se usó para bloquear la actividad de la oxidación biótica de amoníaco AOA y AOB, mientras que la producción acumulada de N2O por otros procesos (nitrificación heterótrofa y procesos abióticos, etc.) contribuyó en una escala notable al bruto de acumulación acumulada. Producción de N2O (Fig. 4). En el futuro, se deben realizar investigaciones adicionales, como el etiquetado de isótopos, para revelar el mecanismo subyacente de otros procesos que conducen a N2O.

Las contribuciones relativas a la producción de N2O de AOA y AOB de dos suelos con tratamientos de corrección de amoníaco después de 21 días de incubación. Las barras de error representan errores estándar de tres réplicas biológicas.

Abundancia de los genes AOB y AOA amoA a los 0 y 21 días de incubación en suelos SX (a y c) y PL (b y d); Las letras diferentes sobre las barras indican una diferencia significativa y las mismas letras indican que no hay diferencia significativa y las barras de error representan los errores estándar de tres réplicas biológicas.

En la actualidad, los inhibidores de la nitrificación60, los fertilizantes de liberación lenta61,62,63, el momento adecuado de aplicación de fertilizantes61,64 y la labranza cero65,66 se consideraron las principales estrategias para aumentar la eficiencia del uso de fertilizantes e inhibir la emisión de N2O. Nuestros resultados evaluaron las consecuencias de la especialización de la oxidación de amoníaco acompañada de un rendimiento variado de N2O de AOA y AOB, lo que proporciona una estrategia potencial para el alivio de las emisiones de N2O en suelos morados en áreas montañosas del río Yangtze superior, China. La producción acumulativa de N2O y el rendimiento de N2O (especialmente en AOB) aumentan significativamente con el aumento del pH de los suelos en condiciones aeróbicas, lo que indica que una reducción en el pH podría ser una forma potencial de disminuir la emisión de N2O. Además, la aplicación de un inhibidor de la nitrificación moderado podría aliviar la emisión de N2O y reducir el riesgo de lixiviación de nitratos en esta área, y este punto de vista fue respaldado por una revisión reciente67. En total, las medidas que previenen la oxidación de amoníaco directamente o que cambian la especialización provocando el aumento del dominio de la oxidación de NH3 por parte de AOA indirectamente, disminuirán la producción de N2O en esta área. Mientras tanto, el rendimiento de los cultivos, la viabilidad de las medidas y el costo deben considerarse con la debida diligencia ambiental que se deriva de la reducción de las emisiones de N2O.

En conclusión, exploramos la contribución relativa de las bacterias oxidantes de amoníaco y las arqueas a la emisión de N2O utilizando un inhibidor seleccionado de AOB en suelos de color púrpura con diferentes valores de pH. Los resultados demostraron que la oxidación del amoníaco estuvo dominada por AOB en lugar de AOA en condiciones aeróbicas y de humedad del suelo WHC del 60 %, tanto en suelos neutros como alcalinos. El suministro de NH4+-N aumentó significativamente la producción de N2O de AOB, mientras que la producción de N2O relacionada con AOA también aumentó cuando se inhibió la actividad de AOB en esta condición. El pH actúa como un factor clave para mediar el cambio de abundancia de AOA y AOB, y la producción de N2O varió con diferentes suelos de pH. Estos resultados pueden ayudar a informar el desarrollo de estrategias de reducción de N2O en el futuro.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Esta investigación fue apoyada por el Proyecto Clave de la Fundación Nacional de Ciencias de China (U20A20107) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41301266).

Key Laboratory of Mountain Surface Processes and Ecological Regulation, Institute of Mountain Hazards and Environment, Chinese Academy of Sciences, #9, Block 4, Renminnanlu Road, Chengdu, 610041, Sichuan, China

Lei Hu, Zhixin Dong y Bo Zhu

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 100049, China

lei-hu

Instituto de Ciencias Geográficas e Investigación de Recursos Naturales, Academia China de Ciencias, Beijing, 100101, China

ZhengWang

Universidad de Tecnología de Chengdu, Chengdu, 610059, China

liwei xiao

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LH y BZ diseñaron los experimentos. LH, ZW y LX participaron en la adquisición y análisis de datos para el trabajo. LH escribió el manuscrito. ZD y BZ lo revisaron críticamente para contenido intelectual importante. Todos los autores aprobaron la presentación.

Correspondencia a Bo Zhu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Hu, L., Dong, Z., Wang, Z. et al. Las contribuciones de las bacterias oxidantes de amoníaco y las arqueas a la emisión de N2O dependiente de la nitrificación en suelos alcalinos y púrpura neutro. Informe científico 12, 19928 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23084-1

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Recibido: 14 junio 2022

Aceptado: 25 de octubre de 2022

Publicado: 19 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23084-1

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