El microbioma oscuro y la cantidad extremadamente baja de materia orgánica en el delta fósil de Atacama revelan los límites de detección de vida en Marte

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 808 (2023) Citar este artículo

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Identificar signos inequívocos de vida en Marte es uno de los objetivos más importantes para el envío de misiones al planeta rojo. Aquí reportamos Red Stone, un delta de abanico aluvial de 163-100 Ma que se formó bajo condiciones áridas en el desierto de Atacama, rico en hematita y lutitas que contienen arcillas como vermiculita y esmectitas, y por lo tanto geológicamente análogo a Marte. Mostramos que las muestras de Red Stone muestran una cantidad importante de microorganismos con una tasa inusualmente alta de indeterminación filogenética, a lo que nos referimos como "microbioma oscuro", y una mezcla de firmas biológicas de microorganismos existentes y antiguos que apenas pueden detectarse con el estado de -Equipos de laboratorio de última generación. Nuestros análisis con instrumentos de banco de pruebas que están o serán enviados a Marte revelan que, aunque la mineralogía de Red Stone coincide con la detectada por instrumentos terrestres en el planeta rojo, niveles igualmente bajos de materia orgánica serán difíciles, si no imposibles, de detectar en Rocas marcianas según el instrumento y la técnica utilizada. Nuestros resultados enfatizan la importancia de devolver muestras a la Tierra para abordar de manera concluyente si alguna vez existió vida en Marte.

Las misiones pasadas, actuales y futuras a Marte están motivadas principalmente por la cuestión pendiente de si alguna vez existió vida en el planeta rojo1. Las misiones aterrizadas como Mars Exploration Rovers, Phoenix y los rovers activos Mars Science Laboratory (MSL) y Mars2020 tenían la tarea de identificar entornos habitables y si existen evidencias de los requisitos para la vida tal como la conocemos2,3. El agua líquida es uno de los requisitos principales, por lo que muchos rovers han aterrizado en sitios con evidencia geomorfológica de ríos y lagos antiguos y/o evidencia mineralógica de agua líquida, como minerales arcillosos4,5,6. Estas naves espaciales están equipadas con varios instrumentos de composición para identificar minerales y buscar moléculas en bruto necesarias para la vida. Los espectrómetros de masas de Viking, Phoenix, MSL, Mars2020 y el futuro rover ExoMars, por ejemplo, pueden detectar moléculas orgánicas y los componentes básicos de la vida7,8,9,10. Aunque no se encontraron evidencias sólidas de compuestos orgánicos en suelos marcianos mediante mediciones Viking o Phoenix11,12, tanto el conjunto de instrumentos Sample Analysis at Mars (SAM) en MSL como el instrumento Scanning Habitable Environments with Raman and Luminescence for Organics and Chemicals (SHERLOC) en Mars2020 identificó moléculas orgánicas alifáticas y aromáticas simples (es decir, ~450 ppm en la lutita de Yellowknife Bay en el cráter Gale13,14).

Los resultados de Marte hasta ahora sugieren que la materia orgánica no prevalece en su superficie, pero aquí planteamos la hipótesis de que las limitaciones actuales de los instrumentos15 y la naturaleza de la materia orgánica en las rocas marcianas también pueden dificultar nuestra capacidad para encontrar evidencias de vida en el planeta rojo. En este trabajo probamos estas limitaciones al inspeccionar de cerca Red Stone, un sitio único ubicado en el Desierto de Atacama, el más seco16,17,18, el desierto más antiguo de la Tierra19,20,21,22,23,24, y un conocido Marte modelo analógico22.

Red Stone se ubica al sur de la ciudad de Antofagasta en la Quebrada del Boku (Fig. 1A, B y Fig. 2), parte del Grupo Way superior, una secuencia sedimentaria de un abanico aluvial-delta de abanico compuesto por las formaciones Coloso y Lombriz que datan del Cretácico Inferior al Jurásico Superior (Fig. 1C y Fig. 2B)25. El Grupo Way representa dos fases distintas de la evolución de la cuenca, registrando la sucesión delta completa de proximal a distal hasta la incursión marina progresiva ulterior y la deposición delta26. La base de la formación Lombriz muestra areniscas rojas y lutitas intercaladas con abundantes vetas perpendiculares y costras de halita endurecidas (Fig. 1D, E y Fig. 3). Subiendo secciones, hay unidades de conglomerados cementados, areniscas y lutitas intercaladas, coronadas por conglomerados sueltos erosionados (Fig. 1E y Fig. 3).

Una ubicación de piedra roja en el desierto de Atacama (modelo de terreno digital86). B Imagen de satélite ampliada en la región circundante (datos de satélite Sentinel 2020). C Reconstrucción paleogeográfica del sistema aluvial/delta mostrado en B, según el registro sedimentario informado de la formación Caleta Coloso-El Way (modificado de Flint, S. Clemmey, H. & Turner, P. The Lower Cretaceous Way Group of northern Chile: un complejo abanico-delta abanico aluvial Sediment.Geology 46, 1-22 (1986)25,87). Las flechas negras en C muestran la dirección del flujo del antiguo delta del río, cuyo punto de origen se encuentra ahora bajo el Océano Pacífico. El punto rojo en A, B y C muestra la ubicación del afloramiento que se muestra en E. D Columna estratigráfica del afloramiento estudiado que se muestra en el panel E. Las flechas rojas muestran los puntos de recolección de muestras. E Vista de cerca del afloramiento estudiado. De arriba a abajo: UZ zona superior, U1 Unidad 1, pared WI en ubicación del sensor, U2 Unidad 2, pared WO ubicación del sensor, zona inferior LZ.

Una vista panorámica del sitio inspeccionado. B Mapa geológico de la formación Caleta Coloso-El Way (SERNAGEOMIN, 2003. Mapa Geológico de Chile: versión digital88). JK1c (verde claro); Secuencias sedimentarias aluviales, fluviales y eólicas de transición. Cretácico Inferior a Jurásico Superior (arenisca, caliza, lutita, conglomerado, limolita). Ki1m (verde); Secuencias sedimentarias marinas costeras. Cretácico inferior (arenisca, caliza, marga, calcarenita). M1c (marrón claro); Secuencias sedimentarias de abanicos aluviales. Mioceno (arena, grava, limo, ignimbrita). J3i (púrpura claro); Secuencias volcánicas continentales y marinas del Jurásico (basaltos, andesitas, tobas, calizas).

A Top erosionado conglomerados sueltos. B Conglomerados cementados. C, D Mostrar areniscas (s) con lutitas de capas finas (m). Las flechas blancas apuntan a vetas de halita/yeso. E Una de las vetas de evaporita después de romperse, exponiendo la halita/yeso dentro de ellas y la fina capa de hematita que las cubre. F Corteza fibrosa de halita paralela a la superficie del afloramiento, solo observable después de haber sido expuesta.

El conjunto de minerales secundarios de las facies sedimentarias de Red Stone presenta similitudes con el antiguo Marte, lo que sugiere historias diagenéticas comparables. Además de cuarzo y plagioclasa, las areniscas están compuestas de zeolita (analcima), calcita, yeso, halita, clorita, vermiculita, ilita/moscovita y hematita (Fig. S1A). La hematita es un marcador de alteración acuosa oxidativa en Marte27,28,29 y está presente en Red Stone como cristales bien desarrollados y revestimientos minerales delgados (Fig. S1B, C), lo que le da un color rojo característico a este sitio (Fig. 2A ). La presencia de halita y yeso, vetas blancas transversales y costras en las facies inferiores de arenisca y lutita Red Stone, además de la halita que cementa las facies superiores de arenisca (Fig. 1D, E y Fig. 3), respaldan las condiciones áridas durante la deposición de los sedimentos de este delta (halita y yeso han sido identificados en antiguas superficies marcianas desde la órbita e in situ30,31,32,33). Los filosilicatos son abundantes en las antiguas superficies marcianas y están dominados por la esmectita y la clorita34. De manera similar, las lutitas de Red Stone contienen esmectita (saponita y montmorillonita) y clorita, junto con ilita y vermiculita (Fig. S1A y Fig. S1D). La presencia de cloritos sugiere condiciones diagenéticas de baja temperatura (70-90 °C)35, similares a las temperaturas experimentadas por las rocas sedimentarias en el cráter Gale investigado por MSL36. Los patrones de difracción de rayos X (XRD) a diferentes humedades relativas (HR) muestran que la posición del pico de clorito se mueve ligeramente debido a la expansión de la distancia entre capas, lo que sugiere que el clorito puede estar absorbiendo pequeñas cantidades de vapor de agua en respuesta a cambios en el medio ambiente. humedad relativa (HR) (Fig. S2), un hallazgo de interés para la inspección de la habitabilidad potencial de este tipo de arcilla en Marte. El cemento de analcima, junto con las arcillas autógenas, la calcita y el cuarzo37 notificados, es típico de las salmueras que se evaporan en cuencas cerradas, similares a los lagos que se formaron en las cuencas de impacto en Marte hace ~3-4 mil millones de años38. Patrones de meteorización usando análisis A-CN-K [Al2O3-(CaO + Na2O) – K2O]39,40 (Fig. S3A), junto con ACN [Al2O3-(CaO + Na2O)] y A-CNK-FM [Al2O3 – ( CaO + Na2O + K2O) – (FeOT + MgO)] Los análisis geoquímicos (Fig. S3B, C) también son indicativos de diagénesis, y las variaciones en el ACN en algunas de las muestras también sugieren otros procesos en acción, como el hidrotermalismo.

Los registradores duales de temperatura/humedad relativa in situ mostraron que los conglomerados sueltos superiores más expuestos mostraban los valores de HR más altos (Fig. S4), con hasta un 85,1 % durante la noche y en las primeras horas de la mañana, en consonancia con la exposición regular a las nieblas en esta región como principal fuente de agua para la vida microbiana41.

Las muestras de Red Stone contienen como máximo 1 μg de ADN por gramo de suelo, con análisis de secuenciación de próxima generación (NGS) de 16 S rRNA que muestran que el mayor número de especies se encontraba entre Alphaproteobacteria y Actinobacteria (Fig. 4A y Tabla S1). La mayor diversidad de unidades taxonómicas operativas (OTU) se encontró en los conglomerados erosionados superiores (Fig. 4B), lo que es consistente con la mayor disponibilidad de agua. Una correlación entre los valores más altos de HR y la diversidad microbiana de NGS confirmó el alto número de OTU en los conglomerados superiores (Fig. S5A), y también reveló un número ligeramente mayor de OTU en la zona donde se encuentran las evaporitas, en línea con el papel de estos minerales en el suministro de una fuente de agua para la vida microbiana debido a la absorción de vapor de agua en respuesta a los cambios en la HR. Las UTO de la zona superior también se encuentran en la zona donde se registran las temperaturas superficiales más altas durante las horas del día (Fig. S4 y Fig. S5B), lo que sugiere que tales especies son al menos termotolerantes.

Un mapa de calor de los principales filos bacterianos determinado por NGS. Los números representan porcentajes de secuencias totales. La intensidad del color en cada cuadro indica el porcentaje relativo de cada filo. B Índices de riqueza (S, barras) y diversidad de Shannon (H', puntos) para las comunidades procarióticas analizadas. C Clasificación jerárquica de las secuencias bacterianas encontradas por NGS. Los colores de la escala de grises identifican las clasificaciones de mayor jerarquía.

Una fracción sustancial de las secuencias de ARNr de NGS 16 S cayó en la categoría "sin clasificar" (8,9 %) (Fig. 4A), mientras que el 40,8 % de las secuencias restantes no pudieron asignarse más allá de taxones superiores, como el orden o el dominio (Fig. 4C), revelando así un alto grado inusual de indeterminación filogenética. El concepto de "materia oscura microbiana" se ha propuesto recientemente para referirse a la porción aún inexplorada de la diversidad microbiana compuesta por microorganismos no caracterizados de phyla conocidos y phyla candidatos sin representantes cultivados42,43,44. Aquí, en cambio, proponemos el nuevo concepto de "microbioma oscuro" para referirnos a la comunidad de microorganismos que se pueden detectar con métodos de alto rendimiento, como la secuenciación directa de ADN (como es el caso de las muestras de Red Stone), pero cuya identidad filogenética aún no se puede determinar. determinado. Por lo tanto, el microbioma oscuro de Red Stone puede estar compuesto por especies existentes verdaderamente novedosas que no se encuentran en ningún otro lugar de la Tierra, pero también puede ser el caso de que dicho microbioma oscuro de hecho represente la comunidad remanente de especies microbianas que solían habitar el delta de Red Stone. en el pasado distante, de los cuales no se encuentran parientes existentes en las bases de datos de secuencias existentes.

Un enfoque dependiente del cultivo nos permitió obtener solo diecinueve aislados bacterianos únicos y dos fúngicos de todo el conjunto de muestras de Red Stone (Fig. S6), con números extremadamente bajos de unidades formadoras de colonias (CFU) (1.1 × 101 - 9.0 × 101, Tabla S2), y casi todas las especies bacterianas pertenecientes a la familia de bacterias heterótrofas Bacillaceae, de acuerdo con los hallazgos de NGS. La mayoría de estas especies coinciden de forma única con la mineralogía de las muestras de las que se aislaron (es decir, se encontró Halobacillus en muestras de evaporita), lo que refleja sus preferencias ecológicas. Se sabe que todas las bacterias aisladas de este sitio usan polvo eólico para moverse a través de Atacama45, lo que sugiere que la región costera en la que se encuentra Red Stone es el principal punto de origen de muchas de las especies que se encuentran tierra adentro.

El análisis elemental reveló contenidos muy bajos de carbono orgánico total (TOC) provenientes de este ensamblaje único de microorganismos, con un máximo de 0,11 % de peso seco y nitrógeno no detectable (Tabla 1). La cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) mostró que la fracción lipídica de este TOC estaba compuesta principalmente por hidrocarburos y ácidos grasos (Fig. 5A). El análisis isotópico de carbono estable mostró valores de δ13C de -19,5 a -26,5‰ (Fig. 5B), siendo las muestras de evaporita las más enriquecidas y con el TOC más alto. Los lípidos característicos de las membranas eucariotas, como los esteroles, no pudieron detectarse mediante GC-MS. La presencia de ácidos grasos con un grupo metilo en la penúltima posición de la cadena ácida (es decir, iso−17:0) sugiere entradas bacterianas donde las bacterias sulfato-reductoras pueden representar una fracción sustancial46. El enriquecimiento de 13C observado en las evaporitas en relación con otras muestras, junto con la detección de ácidos grasos monoinsaturados, isoprenoides (pristano y fitano), heptadeceno y varios monometilalcanos de cadena media, sugieren un origen en fotótrofos como las cianobacterias47,48,49 . Sin embargo, dado que ni la NGS, los análisis microscópicos (campo brillante y autofluorescencia de clorofila) ni el cultivo detectaron tales especies, estas firmas biológicas pueden representar los restos antiguos de los miembros fototróficos del microbioma oscuro que habitaba el abanico aluvial de Red Stone antes de que fuera litificado. . Esta hipótesis también es coherente con el análisis de las muestras de lutita, que también reveló la presencia de una serie de hopanos de carbonos C27 a C31 (Fig. 5A). Los hopanos son los fósiles moleculares más recalcitrantes de los hopanoides, lípidos similares a los esteroides de la familia de los isoprenoides producidos principalmente por bacterias50, nuevamente una biofirma potencial de los antiguos habitantes del delta de Red Stone.

A Contenido de lípidos, incluidos alcanos normales (es decir, de cadena lineal), ácidos grasos normales y ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) identificados mediante espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS). Los rangos de números de carbono se indican entre paréntesis. B Carbono orgánico total (TOC, % dw) y valores de composición isotópica de carbono estable (δ13C, ‰) encontrados. C, D y E muestran las muestras analizadas mediante espectroscopía Raman, mientras que (F) muestra un control positivo en el que se depositó un lípido sobre un sustrato amorfo rico en sílice (panel F modificado con permiso de Carrizo et al.89).

La relación entre la suma de n-ácidos grasos y la suma de n-alcanos puede proporcionar una medida de la frescura de la biomasa en un entorno determinado. Dado que los grupos funcionales de oxígeno, como el carboxilo, tienden a descomponerse con el tiempo, mientras que se acumulan hidrocarburos más resistentes (es decir, alcanos), las proporciones relativamente altas de ácidos grasos n/alcanos pueden interpretarse como un signo de biomasa más fresca51. Las muestras de la parte superior de la estratigrafía y las evaporitas mostraron las proporciones más altas (≥16; Tabla 1), lo que sugiere que estas muestras contienen la biomasa más fresca/reciente, consistente con la mayor diversidad microbiana determinada por NGS y la mayor disponibilidad de agua en estas muestras.

La espectroscopia Raman usando una fuente de 532 nm, similar a la Raman en el conjunto de instrumentos SuperCam del rover Mars 2020, confirmó la presencia de los minerales detectados por XRD (Fig. S7), pero no pudo encontrar ninguna firma de lípidos (Fig. 5C–F) , revelando la elección correcta y crítica de los parámetros Raman, como la fuente del láser y el tamaño del punto en la detección de diferentes tipos de compuestos orgánicos cuando las concentraciones son extremadamente bajas.

La tinción de ADN con SYBR Green fue exitosa para una sola muestra de la zona inferior, que reveló algunas células cocoides y bacilares (Fig. S8). Sin embargo, Catalyzed Reporter Deposition-Fluorescence in situ Hybridization (CARD-FISH) pudo detectar niveles extremadamente bajos de bacterias y arqueas (Figs. S9, S10) en todas las muestras, con los recuentos más altos (solo 6 × 105 células por gramo de muestra) observada en las muestras de conglomerados superiores, nuevamente consistente con estas muestras que tienen la mayor biodiversidad y disponibilidad de agua.

Dado que varias de las técnicas utilizadas para caracterizar primero las muestras de Red Stone dieron evidencias de vida en el límite de detección, fue interesante inspeccionar qué conjunto de instrumentos de banco de pruebas y que se enviarán a Marte detectaría en las muestras de Red Stone, como Las misiones actuales y futuras están investigando específicamente abanicos/deltas de abanicos ricos en arcilla similares52,53.

Mientras que técnicas como DRIFTS (espectroscopía de transformada de Fourier infrarroja de reflectancia difusa), RLS (simulador ExoMars de espectrómetro láser Raman) y LIBS (espectroscopía de descomposición inducida por láser a bordo de los rovers Curiosity y Perseverance) coincidieron estrechamente con la composición mineralógica del sitio (Figs. S11– S13, Tabla S3 y Tabla S4), la detección de compuestos orgánicos resultó ser mucho más desafiante.

La detección de DRIFTS de orgánicos apenas fue posible en la región NIR (Fig. S11A), ya que las bandas más fuertes de las vibraciones en las redes minerales oscurecieron las bandas potenciales de los orgánicos. Solo un único pico a 1,36 μm en los espectros de la muestra de Red Stone podría explicarse por bandas orgánicas no fundamentales. En contraste, se observaron muchas bandas (aunque muy débiles) atribuibles a compuestos orgánicos en la región espectral del infrarrojo medio (MIR) (Fig. S11B; asignaciones en la Tabla S5).

La pirólisis similar a SAM54 de muestras de Red Stone detectó una serie de compuestos orgánicos diferentes (Fig. S14), incluidos aromáticos, aromáticos que contienen oxígeno, cloroaromáticos y aromáticos que contienen azufre. Los compuestos orgánicos específicos, como los alcanos de cadena lineal C12-C35 en las muestras UZ, U1 y U2, se detectaron en una abundancia relativa baja en comparación con los otros compuestos orgánicos (Fig. S14) y se identificaron por sus espectros de masas y tiempos de retención utilizando un alcanos C10-C40. estándar. El hecho de que los alcanos se detectaran en el límite de detección del instrumento comercial utilizado indica que podrían no ser detectables utilizando el modelo de vuelo SAM, que tiene un límite de detección unas diez veces menor en comparación con la versión comercial utilizada aquí (~ppbv) . Sin embargo, los experimentos de química húmeda de derivatización similar a SAM utilizando MTBSTFA-DMF (ver métodos) identificaron moléculas polares y ácidos n-carboxílicos C7-C20 derivatizados en todas las muestras, revelando que la prolina es el único aminoácido detectado (solo en las muestras de conglomerados superiores, Fig. S15), de acuerdo con el metabolismo activo de las bacterias en esta muestra en particular. La detección de ácidos grasos dicarboxílicos e insaturados, junto con el hallazgo de ácidos grasos C16 y C18 y prolina, sugieren que estos compuestos orgánicos serían detectados por el instrumento SAM en Marte. Sin embargo, esto solo sería posible si estas moléculas son abundantes y están sujetas a variables instrumentales que podrían jugar un papel adicional en su detección, como las restricciones de temperatura del instrumento (columna, trampa, líneas de transferencia, etc.), el tiempo límite del análisis de vuelo, la capacidad de desorción de la(s) trampa(s), etc.

Cuando las muestras de Red Stone se analizaron mediante pirólisis flash con el instrumento de banco de pruebas MOMA55 (el analizador de moléculas orgánicas de Marte a bordo del rover Rosalind Franklin ExoMars), no se detectaron compuestos orgánicos (Fig. S16). Sin embargo, cuando estas muestras se derivatizaron con MTBSTFA-DMF (derivatización directa y extracción previa a la derivatización), se identificaron algunos picos, pero solo en muestras de evaporita; especies de ácido carboxílico alifático derivatizadas a través de la sililación de su grupo lábil -OH (Fig. S17). Estos resultados no solo revelaron que la mayoría de las muestras de Red Stone contenían niveles orgánicos por debajo de los límites de detección del MOMA, sino también la importancia crítica de las muestras de campo analógicas como Red Stone para validar la próxima generación de instrumentos de vuelo.

Las muestras de Red Stone también se analizaron con SOLID-LDChip, el detector de signos de vida56,57,58, un instrumento TRL5 diseñado para buscar firmas biológicas moleculares en otros planetas mediante el uso de LDChip (chip detector de vida), un inmunoensayo de sándwich de fluorescencia multiplex. Al igual que en otros análisis de banco de pruebas, las detecciones de SOLID estuvieron justo por encima del límite de detección en las muestras de Red Stone (Fig. S18), pero aún encontraron evidencias de bacterias heterótrofas y, curiosamente, cianobacterias, consistentes con otras firmas biológicas provenientes de los microorganismos existentes y relictos utilizando otras técnicas. . La detección por SOLID de restos antiguos de cianobacterias es de particular interés, ya que confirma que el delta del río Red Stone tenía suficiente agua para sustentar la fotosíntesis hace millones de años, pero ya no, ya que Atacama se secó con el tiempo (similar al caso de Marte).

En conjunto, Red Stone ofrece una colección única de características geológicas y microbiológicas, proporcionando un sitio de modelo analógico excepcional para estudiar la formación y la habitabilidad actual y pasada de un antiguo abanico aluvial/delta de abanico que se formó bajo condiciones áridas en un entorno análogo a Marte59. Los análisis de muestras de Red Stone utilizando bancos de pruebas móviles revelan la relevancia de los experimentos de derivatización de química húmeda para la detección de compuestos orgánicos en espectrómetros de masas, a pesar de que esta técnica no siempre fue capaz de identificar todos los tipos de compuestos orgánicos. Además, el enfoque de inmunoensayo SOLID demostró ser una técnica prometedora para detectar evidencias de vida microbiana, en lugar de solo sus componentes básicos, aunque es posible que los microorganismos marcianos presentes en concentraciones más bajas que las de Red Stone aún no sean detectables. La detección limitada o no detectada por los instrumentos del banco de pruebas del rover de una serie de firmas biológicas de los microbios únicos existentes y extintos en las muestras de Red Stone también resaltan la importancia crítica de una misión de retorno de muestras de Marte, para que las muestras puedan estudiarse a fondo en busca de signos de vida en los laboratorios. en la Tierra60.

El reconocimiento de campo principal y el muestreo del afloramiento Red Stone se llevaron a cabo en agosto de 2019, aunque también se realizaron muestreos posteriores en el sitio en febrero, mayo, agosto y octubre de 2021. Después de medir los alrededores, se seleccionó la exposición más continua para aprovechar la mejor sección poligonal del registro estratigráfico. Tomamos fotos de referencia y de cerca antes y después de recolectar el material, lo suficiente para muestrear no afectado por la intemperie y la cantidad necesaria para el análisis geoquímico. El muestreo se registró metódicamente, incluidas las observaciones de campo y su profundidad con una cinta métrica lo más perpendicular posible al plano de la cama, y se almacenó en bolsas zip y tubos de vidrio con tapas de papel de aluminio para análisis de biofirmas con el etiquetado adecuado. Algunas formaciones frágiles (revestimientos y capas de sal) se almacenaron adicionalmente en tubos falcon, para poder observarlas y analizarlas adecuadamente más adelante en el laboratorio. Tomamos 17 muestras representativas de los diferentes horizontes a lo largo de la secuencia estratigráfica (algunas requirieron muestreo posterior adicional como se mencionó anteriormente) que se representaron en forma de un diagrama de registro gráfico utilizando Strater v5 (Golden Software).

La difracción de rayos X en polvo de las muestras a granel se realizó utilizando un Bruker D8 Eco Advance con radiación Cu Kα y un detector lineal Lynxeye XE-T. Las muestras se escanearon entre 5° (2θ) y 60° (2θ) utilizando un tamaño de paso de 0,05° (2θ) y un tiempo de conteo de 1 s. La identificación de fase se realizó comparando el patrón de difracción medido con patrones de la base de datos PDF con el software DIFFRAC.EVA (Bruker AXS). Posteriormente, la fracción de arcilla se obtuvo por decantación según la ley de Stokes. La determinación de la arcilla implicó el tratamiento: secado al aire, solvatación con etilenglicol y calentamiento a 350 y 500 °C durante 2 h. Luego, las muestras se escanearon con un tamaño de paso de 0,02° (2θ) en el rango de 2-30°(2θ) con un tiempo de recolección de 1 s en cada paso.

Los especímenes orientados de las muestras de roca fueron analizados por XRD (Ultima IV) adjunto con un dispositivo de control de humedad en el Instituto Nacional de Ciencia de Materiales, Japón. Las medidas se realizaron con radiación monocromática CuKα a 40 kV y 30 mA. Las muestras orientadas se secaron en un horno de vacío a 100 °C durante 15 h antes de las mediciones. Los especímenes secos se colocaron en la cámara de muestras. Los patrones XRD de las muestras se midieron bajo una humedad relativa de 1% a 60%.

Para examinar gráficamente las tendencias de meteorización, incluimos algunos de los diagramas ternarios más utilizados que permiten la interpretación gráfica de los cambios químicos proporcionales. Los diagramas ternarios A-CN-K, ACN y A-CNK-FM, trazados con Grapher v13 (Golden Software).

La temperatura y la humedad relativa se midieron en el campo utilizando microregistradores duales de temperatura/humedad iButton (Maxim Integrated, San Jose, CA, EE. UU.) como se hizo anteriormente18,23, y se configuraron para tomar datos cada 15 minutos durante 2 meses.

Las muestras de piedra roja se almacenaron a temperatura ambiente y luego se enumeraron mediante recuentos directos en el laboratorio. Como la visualización celular es menos eficiente cuando los minerales enmascaran las células mediante la adsorción de colorantes tradicionales, utilizamos SYBR Green I (Molecular Probes, Eugene, EE. UU.) en lugar de DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato). Brevemente, 2 g de cada muestra se suspendieron en 10 ml de pirofosfato tetrasódico 0,01 M y se sonicaron suavemente en un limpiador ultrasónico Branson (Danbury, EE. UU.) durante 30 min en agua enfriada con hielo. Después de 10 s de sedimentación, se tomaron 2 mL del sobrenadante y se colocaron directamente en un filtro de membrana de policarbonato Isopore negro (0.2 μm de tamaño de poro, Millipore, Massachusetts, EE. UU.). Luego, las membranas se incubaron con 1.5 mL de SYBR Green I (50 μg/L) durante 15 min en la oscuridad. Luego, las membranas se lavaron con 10 ml de agua destilada y se dejaron en la oscuridad para que se secaran al aire. Se depositó una gota de aceite de inmersión sobre un portaobjetos de vidrio, luego se depositó el filtro y otra gota de aceite sobre la superficie del filtro y se cubrió con una cubierta de vidrio. Las bacterias se contaron inmediatamente utilizando el microscopio de fluorescencia Zeiss AxioImager M.2 (Carl Zeiss, Jena, Alemania) y un objetivo de inmersión en aceite Plan-Apo 63x ⁄ 1,4 Zeiss. Se utilizó un conjunto de filtros para eGFP (Zeiss Filter Set 38; Excitation ⁄ Emission: 450–490 ⁄ 500–550 nm) para la visualización de bacterias teñidas con SBI. Las bacterias se contaron seleccionando campos de visión aleatorios, con 20 campos por filtro analizado. Se contaron cinco filtros por muestra, para un total de 10 filtros y 200 campos observados.

Las muestras para la hibridación in situ con fluorescencia por depósito informador catalizado (CARD-FISH) se fijaron con formaldehído al 4% en PBS y se almacenaron a 4° hasta su posterior análisis. Los microorganismos se separaron de las partículas minerales mediante sonicación y se filtraron en membranas negras de 0,22 mm (Millipore, Alemania) en condiciones asépticas como se describe en la ref. 61. Los experimentos CARD-FISH, la contratinción y sus respectivos controles de autofluorescencia y unión inespecífica se realizaron como se describió anteriormente en detalle62. CARD-FISH se realizaron utilizando sondas mixtas EUB338 I-III63,64 y ARC91565. Además, CARD-FISH con NON33866 se realizó como control de hibridación adicional. Las muestras se visualizaron y tomaron imágenes como ya se informó61.

Las muestras de Red Stone se almacenaron a temperatura ambiente y se extrajo su ADN en el laboratorio utilizando el kit DNeasy PowerSoil Pro (Quiagen, Düsseldorf, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se realizó anteriormente18,23,41.

Las concentraciones de ADN fueron cuantificadas por Picogreen. Luego, se utilizó una entrada variable de ADN y un número variable de ciclos en una primera PCR con Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) en presencia de:

Cebadores de 100 nM para amplificación de 16 S (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACCTACGGGNGGCWGCAG-3' y 5'- TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACTACHVGGGTATCTAATCC-3', estos cebadores amplifican la región V3-V4 de 16 S), cebadores de 200 nM para amplificación de 18 S (5'-ACACTGACGACATGGTTCTAC AGCCAGCAVCYGCGGTAAY- 3' y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTCCGTCAATTHCTTYAART-3'), cebadores 200 nM para amplificación de Archaea (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACACGGRAAACTGGGGATAAT-3' y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTTRTTACCGCGGCGGCTGBCA-3'), cebadores 200 nM en el caso de ITS (5'-AC ACTGACGACATGGTTCTACATCCTCCGCTTATTGATATGC- 3' y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGTGAATCATCGAATCTTTGAA-3') y cebadores 200 nM para cianobacterias (5'-ACACTGACGACATGGTTCTACAGGGGAATYTTCCGCAATGGG-3' como Forward, y 5'-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGACTGGGGTATCTAATCCCATT-3' o 5'-TACGGTAGCAGAG ACTTGGTCTGACTACAGGGGTATCTAATCCCTTT-3' como inversa). Tras la primera PCR, se realizó una segunda PCR de 12 o 14 ciclos con Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs) en presencia de 400 nM de cebadores (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGACGACATGGTTCTACA-3' y 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-[código de barras de 10 nucleótidos]-TACGGTAGCAGAGACTTGGTCT-3') de Access Array Barcode Library for Illumina Sequencers (Fluidigm).

Los amplicones finalmente obtenidos fueron validados y cuantificados por Bioanalyzer y un pool equimolecular fue purificado por electroforesis en gel de agarosa y valorado por PCR cuantitativa usando el "Kapa-SYBR FAST qPCR kit forLightCycler480" y un estándar de referencia para la cuantificación. El conjunto de amplicones se desnaturalizó antes de sembrarlos en una celda de flujo a una densidad de 10 pM, donde se formaron grupos y se secuenciaron utilizando un "MiSeq Reagent Kit v3", en una ejecución de secuenciación de 2 × 300 pares en un secuenciador MiSeq. Notamos aquí que no se encontraron secuencias de arqueas o eucariotas (excepto algunos contaminantes fúngicos bien conocidos), por lo que solo se presentan datos de 16 S en el informe principal. Todos los datos de secuencia sin procesar se depositaron en el Archivo de lectura de secuencias de NCBI (SRA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con el número de acceso PRJNA908755.

Las secuencias sin procesar se procesaron en el software MOTHUR v.1.43.067, utilizando un script personalizado basado en MiSeq SOP68, como se empleó anteriormente before69,70,71,72,73. La riqueza microbiana de OTU (S) y el índice de diversidad de Shannon (H') se calcularon con lenguaje R para computación estadística (R Core Team, 2019), utilizando el paquete "vegano" v.2.5-674. Para la mejor visualización de la composición de la comunidad bacteriana se construyó un mapa de calor mediante el software STAMP v.2.1.375.

En el laboratorio, las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y luego se inocularon asépticamente en placas de Petri que contenían agar y caldo Luria-Bertani (Sigma-Aldrich, Missouri, EE. UU.), Marine Media o medio de crecimiento Czapek Dox modificado (CondaLab, Torrejón de Ardoz, España). Esto se hizo asperjando directamente un total de 100 mg por muestra de suelo en las cajas de Petri que contenían los medios antes mencionados, incubando estas placas a 25 °C. En la mayoría de los casos, las colonias que surgían de las partículas del suelo eran evidentes 2 semanas después de la inoculación. A continuación, todas las colonias se volvieron a cultivar en los medios en los que se aislaron por primera vez, para obtener suficiente biomasa para la posterior extracción y almacenamiento de ADN.

Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente y se extrajo el ADN de ellas en el laboratorio utilizando el kit microbiano DNeasy UltraClean (Quiagen, Düsseldorf, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y como se realizó anteriormente18,21,41.

Como se realizó anteriormente18,21,41, los genes 16 S rRNA de aislados bacterianos se amplificaron en el laboratorio utilizando GoTaq Green Master Mix (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y los cebadores 341 f (5′CCT ACG GGNGGC WGC AG3′) y 785r (5′GAC TAC HVGGG TAT CTA ATC C′). Las condiciones de PCR utilizadas fueron: 95 °C por 5 min y 25 ciclos de (95 °C por 40 s, 55 C por 2 min, 72 °C por 1 min) seguido de 72 °C por 7 min. El ARNr de 18 S de aislados fúngicos se amplificó en el laboratorio utilizando GoTaq Green Master Mix (Promega, Wisconsin, EE. UU.) y los cebadores F566 (5'CAG CAG CCG CGG TAA TTCC3′) y R1200 (5'CCC GTG TTG AGT CAA ATT AG C3'). Las condiciones de PCR utilizadas fueron: 95 °C durante 15 min y 35 ciclos de (95 °C durante 45 s, 60 °C durante 45 s, 72 °C durante 1 min) seguido de 72 °C durante 10 min. Las reacciones resultantes se visualizaron en un gel TAE de agarosa al 2% a 50 V. La secuenciación automática de los productos de PCR resultantes fue realizada por Macrogen DNA Sequencing Inc. (Seúl, Corea). Se verificó la calidad de las secuencias usando el software BioEdit (Ibis Therapeutics, Carlsbad, EE. UU.) y se recortaron los extremos antes de usar la opción Megablast para secuencias muy similares del algoritmo BLASTN contra la base de datos no redundante del Centro Nacional de Información Biotecnológica (www.ncbi.nlm. nih.gov) para buscar las especies más cercanas de cada uno de los aislamientos obtenidos.

El análisis filogenético de las secuencias del gen 16 S rRNA y 18 S rRNA aislado se realizó mediante la alineación de secuencias mediante la comparación de múltiples secuencias por expectativa logarítmica, analizadas con jModelTest y luego con Phylip NJ (bootstrap 10,000), todas las herramientas del software de análisis filogenético Bosque disponible gratuitamente (versión 1.7.152)134. Todas las secuencias de genes aislados se han depositado en la base de datos de secuencias genéticas de NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) tanto para 16 S rRNA (OP955639 a OP955657) como para secuencias de 18 S rRNA (OP954719 y OP962462) ).

Submuestras liofilizadas de suelos (10 a 20 g), se enriquecieron con estándares internos de n-alcanos (tetracosano-D50) y ácidos n-alcanoicos (ácido mirístico-D27) y luego se extrajeron con una mezcla de diclorometano y metanol (DCM:/ MeOH, 3:1, v/v) por ultrasonidos (3 ciclos de 10 min). El extracto de lípidos totales (TLE) se concentró a ~0,5 ml usando evaporación rotatoria y luego se digirió durante la noche a temperatura ambiente en una mezcla de potasio metanólico (6 % p/p), luego se separó en fracciones neutras y ácidas. La fracción lipídica neutra se obtuvo extrayendo la mezcla metanólica de potasio con 30 ml de n-hexano (Hx) tres veces, rotavaporando y recuperándola con ~1 ml de Hx:DCM (9:1, v/v). La fracción lipídica ácida se obtuvo agregando HCl a la mezcla potásica metanólica restante y extrayéndola con 30 ml de Hx (tres veces), luego se concentró mediante evaporación rotatoria y se recogió con DCM. Se realizó una separación adicional de la fracción neutra en subfracciones no polares (hidrocarburos) y polares eluyendo la fracción neutra concentrada (~1 ml de Hx:DCM) en una columna de alúmina usando ~0,5 g de polvo de Al2O3 en un sistema Pasteur precombustido. pipeta con 4,5 ml de Hx:DCM (9:1, v/v) y 3 ml de DCM:metanol (1:1, v/v), respectivamente. Tanto las fracciones no polares como las ácidas se analizaron por espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS), por inyección directa en Hx, la primera, o por inyección después de la derivatización con BF3 en MeOH para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). El análisis GC-MS se realizó utilizando un sistema GC 6850 acoplado a un MSD 5975 VL con un detector de triple eje (Agilent Technologies) que opera con ionización electrónica a 70 eV y barrido de m/z 50 a 650. Se inyectó 1 µl de analitos y separado en una columna HP-5MS (30 mx 0,25 mm id x 0,25 µm de espesor de película) con He como gas portador a un flujo constante de 1,1 ml·m−1. Para el análisis de la fracción no polar, la temperatura del horno se programó para aumentar gradualmente de 50 °C a 130 °C a 20 °C·min−1 y luego a 300 °C a 6 °C·min−1 (mantenida 20 min). ). Para el análisis de la fracción ácida, la temperatura del horno se programó de 70 °C a 130 °C a 20 °C·min−1 y luego a 300 °C a 10 °C·min−1 (mantenida 10 min). La temperatura del inyector se fijó a 290 °C, la línea de transferencia a 300 °C y la fuente MS a 240 °C. La identificación de compuestos se basó en la comparación de espectros de masas con materiales de referencia, y su cuantificación en el uso de curvas de calibración externas de n-alcanos (C10 a C40) y ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME; C8 a C24). Todos los productos químicos y estándares fueron suministrados por Sigma Aldrich (San Luis, Missouri, EE. UU.). La recuperación de los patrones internos promedió 71 ± 14%.

La composición de isótopos estables del carbono orgánico (δ13C) se midió en las muestras de suelo a granel mediante espectrometría de masas de relación isotópica (IRMS), siguiendo el método USGS76. Brevemente, todas las muestras se homogeneizaron moliéndolas con un mortero y una maja. Luego se descarbonizaron (suelos) con HCl (3 N) y, después de 24 h de equilibración, se ajustaron a pH neutro con agua ultrapura. Las muestras se secaron en estufa (50 °C) hasta peso constante. Las proporciones de δ13C y δ15N se midieron en un IRMS MAT 253 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) y se informaron en la notación estándar por mil (‰). Se utilizaron tres estándares certificados (USGS41, IAEA-600 y USGS40) con una precisión analítica de 0,1 ‰. El contenido de carbono orgánico total (% TOC) se midió con un analizador elemental (HT Flash, Thermo Fisher Scientific, Waltham Massachusetts, EE. UU.) durante la medición de los isótopos estables.

Los espectros Raman se realizaron excitando la muestra con un láser de estado sólido Nd:YAG no polarizado de 532 nm de longitud de onda. Después de enfocar en un monocromador (Horiba Jobin Yvon HRi550), con una rejilla de difracción de 1200 surcos/mm, la luz dispersada se detectó con un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD), 1024×256 píxeles, enfriado a 203 K para reducción de ruido térmico . El espectrómetro está conectado por fibra óptica a un microscopio B&W Tek con un objetivo de 50x que permite un tamaño de punto sobre la muestra de 42 µm (Microbeam SA, España). La resolución espectral, con ancho de rendija de 200 µm, resulta mejor que 5 cm-1. Los espectros Raman se tomaron en un rango de potencia láser de 20 a 150 mW, 10 a 100 s de tiempo de integración y 3 acumulaciones.

La caracterización infrarroja de las muestras de piedra roja se realizó en INAF-Observatorio Astrofísico de Arcetri (Florencia, Italia) utilizando un interferómetro de doble péndulo de haz único VERTEX 70 v (Bruker), equipado con un accesorio de reflexión difusa Praying MantisTM (Harrick DRIFT) para llevar análisis de espectroscopía de transformada de Fourier infrarroja de reflectancia difusa (DRIFTS). Específicamente, adquirimos espectros de reflectancia en la región espectral de 400-8000 cm-1, usando una resolución de 4 cm-1, una fuente Globar, un divisor de haz KBr, un detector DTGS y en la región espectral de 8000-20000 cm-1, usando una resolución de 8 cm−1, una fuente de tungsteno, un divisor de haz de CaF2 y un detector de InGaAs, para cubrir todo el rango espectral relevante para los instrumentos de vuelo espacial como SuperCam (rango espectral 1.3-2.6 μm + 0.4–0.85 μm) a bordo de la misión del rover Mars 2020 de la NASA, Ma_MISS (rango espectral de 0,5 a 2,3 μm), ISEM (rango espectral de 1,1 a 3,3 μm) y MicrOmega (rango espectral de 0,95 a 3,65 μm + 0,5 a 0,9 μm) a bordo del rover ESA-Roscosmos ExoMars 2022 misión.

Las muestras de Red Stone se trituraron en un mortero de ágata y se tamizaron con un juego de tamices de diferente tamaño de poro, con el fin de obtener tamaños de partículas iguales o menores a 250 μ. La FT Raman se realizó con un instrumento Bruker RFS 100 con una fuente de excitación de 1064 nm y una mancha de 100 micras. Se adquirieron dos espectros de dos puntos diferentes usando un total de 1024 escaneos por espectro. Análisis Micro Raman a 633 nm. Para este fin se utilizó una fuente de excitación de 633 nm, y un microscopio NIKON como óptica de enfoque/recolección, dando tamaños de punto de análisis variables, dependiendo del objetivo, llegando a puntos de 25 micras. La espectroscopia de alto rendimiento se realizó con un Holospec 1.8i y un cabezal Raman de Kaiser Optical Systems. Para los análisis guiados por el operador, se analizaron cuatro espectros diferentes para los componentes principales, junto con el enfoque en los granos individuales. Para el simulador RLS se adquirió la adquisición automática sobre un total de cien puntos de 50 micras, con un sistema automatizado descrito en la ref. 77.

Se realizaron cinco observaciones de 30 disparos de láser cada una en las muestras con la réplica de laboratorio del instrumento ChemCam. Las muestras se situaron a 1,6 metros del instrumento, contenidas en una cámara rodeada de 7 Torr de CO2 para imitar la atmósfera de Marte. Los datos LIBS se preprocesaron utilizando los métodos descritos en 78 para eliminar el fondo y el continuo que no son láser, y para calibrar la longitud de onda. Las observaciones TRLS (espectroscopia de luminiscencia resuelta en el tiempo) se realizaron con una réplica de laboratorio del instrumento SuperCam.

El experimento de pirólisis similar a un vuelo se realizó utilizando un pirolizador de múltiples disparos 3030D de Frontier Laboratories de la compañía Quantum Analytics. Las muestras se pulverizaron y se depositaron alícuotas (~20 mg) en la copa de pirólisis de acero inoxidable. Las muestras se calentaron de 40 a 850 °C a 35 °C/min, lo que reprodujo la velocidad de la rampa de pirólisis utilizada en el instrumento Sample Analysis at Mars (SAM) a bordo del rover Curiosity79. Los experimentos de espectrometría de masas por cromatografía de gases (GC-MS) se realizaron en un GC 1310 de trazas acoplado a un espectrómetro de masas de cuadrupolo ISQ (ambos de la compañía Thermo Fisher). El GC estaba equipado con una columna capilar MXT-5 de Restek (30 m de largo x 0,25 mm de DI unida con una fase estacionaria de 0,25 µm de espesor) similar a la utilizada por el SAM y que permitía analizar y separar una amplia gama de moléculas (~C5 -C30). La rampa de GC se calentó inicialmente a 35 °C y se mantuvo durante 5 min, seguida de una rampa de 5 °C/min hasta 300 °C, mantenida durante 2 min. El gas portador fue helio y se ajustó a 1,2 ml/min. Las muestras se analizaron en modo splitless y las temperaturas del inyector, la línea de transferencia y la fuente de iones se establecieron en 300 °C. El MS se configuró para escanear rangos de masas entre m/z 40 y 535 amu. Durante la duración de la pirólisis, los volátiles quedaron atrapados en la entrada de la columna mediante una trampa fría de nitrógeno líquido de vidrio ubicada dentro del horno de GC, justo después del inyector de GC. Cuando terminó la pirólisis, la trampa fría se detuvo y se calentó, por lo que puede comenzar el análisis de GC. Se realizaron blancos entre cada análisis simple para prevenir y controlar posibles contaminaciones. MTBSTFA-DMF es uno de los dos reactivos de química húmeda presentes en el instrumento SAM54. La derivatización de MTBSTFA es una técnica de sililación no selectiva que facilita la extracción y detección de moléculas polares (p. ej., aminoácidos, ácidos grasos) que no pueden analizarse directamente mediante pirólisis-GCMS y se demostró que funciona en Marte para detectar moléculas polares80. Los experimentos de derivatización de SAM se imitaron en el laboratorio depositando ~20 mg de muestra sólida en la copa de pirólisis, que a su vez se colocó en un vial abierto de 2 ml. Las muestras se enriquecieron con 40 nmol de DL-Fluorovaline utilizado como estándar interno para controlar la eficiencia de derivatización después del análisis. Luego, las muestras se secaron durante ~48 h a 40 °C para limitar la interferencia del reactivo MTBSTFA con el agua adsorbida en la muestra. Antes del análisis de pirólisis, se depositaron 20 uL de MTBSTFA-DMF en la copa de muestra y se calentaron a 75 °C durante 15 min después de sellar el vial. Además, para imitar el primer paso de calentamiento de SAM, esta temperatura se optimizó previamente y se demostró que es la más eficiente para derivatizar moléculas polares estándar. Después de calentar, la copa se cargó rápidamente en el pirolizador para minimizar la evaporación del solvente MTBSTFA. Luego, la muestra se calentó desde 75 °C hasta 850 °C en condiciones similares a las de SAM utilizando la velocidad de calentamiento de SAM de 35 °C/min. La columna cromatográfica se calentó inicialmente a 40 °C (sin mantenimiento), seguida de una primera rampa de 10 °C/min hasta una temperatura de 80 °C, seguida de una segunda rampa de temperatura de 5 °C/min hasta una temperatura final de 310 °C mantenida durante 5 min para hornear la columna antes del siguiente análisis. En cuanto al experimento de pirólisis, el gas portador utilizado fue helio y se fijó a un caudal de 1,2 ml.min−1 con un caudal partido de 75 ml/min para limitar la saturación de los reactivos. La fuente de iones MS y la línea de transferencia se configuraron a 300 °C y los iones producidos por la fuente de ionización de electrones de 70 eV se escanearon con relaciones masa-carga (m/z) comprendidas entre 40 y 535 con un tiempo de escaneo de 0,2 s. desde 9 min (retraso del solvente) hasta el final de la corrida.

Pirólisis: todos los procedimientos instrumentales se realizaron utilizando un pirolizador multidisparo Frontier Laboratories 3030D (FrontierLab) montado en el inyector split/splitless de un cromatógrafo de gases Trace Ultra acoplado a un espectrómetro de masas de cuadrupolo ISQ (Thermo Fisher).

Se pesaron 20 mg de cada muestra en una copa de acero limpiada orgánicamente (precisión de microescala: 0,01 mg) y se colocaron en la parte superior del pirolizador (frío). Luego, la copa se introdujo en el horno del pirolizador calentado a 400 °C o 600 °C y se mantuvo durante 30 s a esta temperatura. El contenido gaseoso de la muestra se transfirió directamente a una columna tipo MOMA MXT-5 (20 m de largo; 0,25 mm de diámetro interno; 0,25 μm de espesor de fase estacionaria) (Restek) para la separación cromatográfica. El inyector se ajustó a 250 °C y el programa de temperatura del GC comenzó a 40 °C seguido de una rampa de 10 °C. min−1 para alcanzar una temperatura final de 300 °C, y se mantuvo durante 10 min a 300 °C. En cuanto al espectrómetro de masas, la fuente de iones y la temperatura de la línea de transferencia se calentaron a 300 °C, y el haz de electrones de la fuente de iones se fijó en 70 eV para escanear la relación entre masa y carga de iones (m/z) de 10 a 600.

Derivatización: todas las muestras se derivatizaron con un reactivo de sililación presente en el conjunto instrumental del MOMA, N,N-metil-terc-butil-dimetilsililtrifluoroacetamida (MTBSTFA). Se añadió N,N-dimetilformamida (DMF) a MTBSTFA (1:4) como disolvente y para ayudar a promover la reacción de derivatización81. Se llevaron a cabo dos métodos de derivatización: un método de derivatización directa y extracción antes de la derivatización.

Derivatización directa; Se transfirieron 50 mg de cada muestra a un vial de vidrio (precisión de microescala: 0,01 mg). Se añadieron 100 μL de reactivo de derivatización y 1 μL de patrón interno (laurato de metilo 10−2 M en acetato de etilo). A continuación, la solución se calentó a 75 °C durante 15 min. Se inyectaron manualmente 0,5 μL del sobrenadante en el instrumento GCMS.

método de extracción; Debido a que la materia orgánica presente en las muestras se encontró ausente o en muy baja abundancia con el experimento de pirólisis, se procedió a una extracción previa a la derivatización para concentrar el contenido orgánico. Se transfirieron 50 mg de la muestra a un vial de vidrio (precisión de microescala: 0,01 mg). Se añadieron a la muestra 250 μl de una solución (1:1) de agua y metanol para extraer compuestos solubles en agua como aminoácidos y otros compuestos orgánicos que tienen una mayor solubilidad en disolventes orgánicos como ácidos grasos. Las tapas roscadas se sellaron adicionalmente con parafilm para evitar fugas de agua y los viales se colocaron en un baño ultrasónico (Branson 2200) durante 2 h. Luego, la solución líquida se transfirió a un tubo Eppendorf y se centrifugó para separar las fases. El tubo se calentó a 75 °C bajo un flujo de nitrógeno hasta que se evaporó la fase líquida. Se agregaron 50 μL de agente de derivatización y 1 μL de patrón interno (igual que antes). La muestra se calentó a 75 °C durante 15 min y se inyectaron manualmente 0,5 μL del sobrenadante con una microjeringa al GC. La presencia potencial de contaminantes químicos de los tubos Eppendorf a través del calentamiento se evaluó mediante GC-MS de control y no se detectó contaminación. Se realizaron dos réplicas para cada muestra para ambos métodos para asegurar la repetibilidad de nuestros experimentos. Todos los procedimientos instrumentales se realizaron en un cromatógrafo de gases Trace 1300 acoplado a un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ 9000. Utilizamos una columna RTX-5 estándar (30 m de largo; 0,25 mm de diámetro interno; 0,25 μm de espesor de fase estacionaria) de Restek. El programa de temperatura y los parámetros del espectrómetro de masas fueron los mismos que para los experimentos de pirólisis.

Un inmunosensor basado en micromatrices de 200 anticuerpos (LDChip o Life Detector Chip), el núcleo del instrumento SOLID (Signs of Life Detector) desarrollado para la exploración planetaria, se dirige a una amplia variedad y tamaños moleculares de biomarcadores microbianos, en su mayoría polímeros82,83,84 . La fracción de IgG de los anticuerpos policlonales se imprimió en microarrays de patrones de puntos por triplicado en portaobjetos de vidrio de microscopio para que se puedan configurar 9 LDChip completos por portaobjetos como se describió anteriormente85. La lista completa de anticuerpos en LDChip se puede encontrar en la ref. 86. Las muestras molidas sólidas se procesaron siguiendo un procedimiento similar al automático perfumado por el instrumento SOLID. Brevemente, se resuspendieron 0,5 g en 2 ml de solución salina tamponada con Tris para lisis/incubación con tampón Twin20 reforzado doble (TBSTRR) (0,4 MTris-ClH, pH 8, NaCl 0,3 M, Tween 20 al 0,1 %), ultrasonicado durante 3 × 1 min. pulsos y filtrado a través de 20 micras para eliminar las partículas gruesas86. Luego, 50 uL de cada extracto crudo se incubaron durante 8 h a 4 °C con LDChip en cada cámara correspondiente del Módulo de Análisis MultiArray (MAAM)71 que simula la Unidad de Análisis de Muestra (SPU) SOLID. El control en blanco solo contenía tampón. Después de lavar con tampón TBSTRR, todas las cámaras se incubaron con 50 ul de una mezcla de anticuerpos marcados con fluorescencia (0,5-1 ug/ml cada uno) durante 12 ha 4 °C como trazadores para las inmunorreacciones. Después de lavarlos y secarlos, los chips se escanearon en busca de fluorescencia, la imagen se procesó, cuantificó y analizó como se describe en otro lugar85,86.

Disponibilidad de datos y materiales: todos los datos y muestras están disponibles gratuitamente previa solicitud a AAB. Todos los datos de secuencia sin procesar de NGS se depositaron en el Archivo de lectura de secuencias de NCBI (SRA, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) con el número de acceso PRJNA908755. Todas las secuencias de genes aislados se han depositado en la base de datos de secuencias genéticas de NIH (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) tanto para 16 S rRNA (OP955639 a OP955657) como para secuencias de 18 S rRNA (OP954719 y OP962462) ). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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La investigación que conduce a estos resultados es una contribución del Proyecto "MarsFirstWater", financiado por el Consejo Europeo de Investigación, Consolidator Grant no 818602 a AGF, y por Human Frontiers Science Program grant n° RGY0066/2018 a AA-B. El financiamiento adicional proporcionado fue proporcionado por la subvención MINECO PID2019-107442RB-C32 (OP-B. y AM), subvenciones en ayuda para la investigación científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia números de subvención 17H06458 y 21H04515 (KF), números de subvención 17H06456 , 17H06458, 20H00195, y 21H04515 (KF y YS), Consejería de Educación e Investigación, Comunidad Autónoma de Madrid/Programa Fondo Social Europeo (MAFM), subvención n° ESP2017-87690-C3-3-R (DC), Ramón y Beca Cajal n° RYC2018-023943-I (LS-G.), Beca AEI MDM-2017-0737 y Beca MCIN/AEI PID2019-107442RB-C32 (VM-I.), MCIU/AEI (España) y FEDER (UE ) concesión n° PGC2018-094076-B-I00 (JW y CA), acuerdo de la Agencia Espacial Italiana 2017-48-H.0 (TF, JRB y GP), concesión del Ministerio de Ciencia de España PID2019-107442RB-C31 (JAM , MV, GLR, AA y FR), el programa de becas de excelencia de María Zambrano (CA3/RSUE/2021-00405), financiado por el Ministerio de Universidades de España (MFM), los contratos del Programa de Exploración de Marte de la NASA NNH13ZDA018O, NNH15AZ24I, NNH13ZDA018O y el Laboratorio LANL Financiamiento de Investigación y Desarrollo Dirigido (LDRD) XX5V (AMO, RCW, AR y SMC), subvención de NASA-GSFC NNX17AJ68G (MM y SSJ), NES centrado en el análisis de muestras en la misión Mars of the Mars Science Laboratory y Mars Organic Molecules Analyzer of la misión Exomars 2022 (OM, CS y CF), y las subvenciones RTI2018-094368-B-I00 y MDM-2017-0737 Unidad de Excelencia "Maria de Maeztu"- Centro de Astrobiología (INTA-CSIC) del Ministerio de Ciencia e Innovación/Agencia Estatal de Investigación MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 y por “FEDER Una forma de hacer Europa” (CE, MGV, MM-P., y VP). RCW agradece a Dot Delapp por realizar el procesamiento previo de los datos LIBS. Los autores también agradecen al explorador terrestre USGS por proporcionar los datos satelitales de Sentinel 2020.

Centro de Astrobiología (CAB) (CSIC-INTA), 28850, Madrid, Spain

Armando Azua-Bustos, Alberto G. Fairén, Olga Prieto-Ballesteros, Daniel Carrizo, Laura Sánchez-García, Victor Parro, Cristina Escudero, Victoria Muñoz-Iglesias, Maite Fernández-Sampedro, Antonio Molina, Miriam García Villadangos & Mercedes Moreno-Paz

Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Autónoma de Chile, Santiago, Chile

Armando Azua-Bustos

Departamento de Astronomía, Universidad de Cornell, Ithaca, 14853, NY, EE. UU.

Alberto G. Fairén

Facultad de Ciencias, Universidad de Tarapacá, Arica, Chile

Carlos González-Silva

Department of Ecology, Universidad Autónoma de Madrid, 28049, Madrid, Spain

Miguel Ángel Fernández-Martínez

Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC), 28006, Madrid, Spain

Jacek Wierzchos y Carmen Ascaso

INAF-Observatorio Astrofísico de Arcetri, Florencia, Italia

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José Antonio Manrique, Marco Veneranda, Guillermo Lopez-Reyes, Aurelio Sanz-Arranz & Fernando Rull

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Jose Antonio Manrique

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Centro de Vuelo Espacial Goddard de la NASA, División de Exploración del Sistema Solar, Greenbelt, MD, 20771, EE. UU.

Maeva Millán

LATMOS/IPSL, UVSQ Paris-Saclay University, Sorbonne University, CNRS, 11 Bd d'Alembert, 78280, Guyancourt, Francia

Maeva Millán

Programa de Ciencia, Tecnología y Asuntos Internacionales, Universidad de Georgetown, Washington, DC, 20057, EE. UU.

Sarah Stewart Johnson, Ophelie McIntosh, Cyril Szopa y Caroline Freissinet

Earth-Life Science Institute (ELSI), Instituto de Tecnología de Tokio, Tokio, Japón

Yasuhito Sekine

Instituto de Naturaleza y Tecnología Ambiental, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Yasuhito Sekine y Keisuke Fukushi

División de Sistemas Naturales, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Koki Morida y Kosuke Inoue

Instituto Nacional de Ciencia de los Materiales, Tsukuba, Japón

Hiroshi Sakuma

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elizabeth rampe

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Conceptualización: AA-B., AGF, CG-S. Metodología: AA-B., AGF Investigación: AA-B., CG-S., OP-B., DC, LS-G., VP, MAF-M., CE, VM-I., MF-S. , AM, MGV, MM-P., JW, CA, TF, JRB, GP, JAM, MV, GL-R., AS-A., FR, AMO, RCW, AR-N., SMC, MM, SSJ , OM, CS, CF, YS, KF, KM, KI, HS Visualización: AA-B., AGF, CGS, OPB, DC, LS-G., VP, MAF-M., CE, VM-I., MF-S., AM, MGV, MM-P., JW, CA, TF, JRB, GP, JAM, MV, GL-R., AS-A., FR, AMO, RCW, AR-N., SMC , MM, SSJ, OM, CS, CF, YS, KF, KM, KI, HS, ER Validación: AA-B., AGF, CG-S., OP-B., DC, LS-G., VP, MAF-M., CE, VM-I., MF-S., AM, MGV, MM-P., JW, CA, TF, JRB, GP, JAM, MV, GL-R., AS-A., FR, AMO, RCW, AR-N., SMC, MM, SSJ, OM, CS, CF, YS, KF, KM, KI, HS, ER Supervisión: AGF. Redacción-borrador original: AA-B. Redacción—revisión y edición: AA-B., AGF, C.GS., OP-B., DC, LS-G., VP, MAF-M., CE, VM-I., MF-S., AM , MGV, MM-P., JW, CA, TF, JRB, GP, JAM, MV, GL-R., AS-A., FR, AMO, RCW, AR-N., SMC, MM, SSJ, OM , CS, CF, YS, KF, KM, KI, HS, ER

Correspondencia a Armando Azua Bustos.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Hamidah Idris, Carol Stoker y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Azua-Bustos, A., Fairén, AG, González-Silva, C. et al. Microbioma oscuro y materia orgánica extremadamente baja en el delta fósil de Atacama revelan los límites de detección de vida en Marte. Nat Comun 14, 808 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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Recibido: 28 junio 2022

Aceptado: 17 de enero de 2023

Publicado: 21 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36172-1

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