La modulación recíproca de la producción de amoníaco y melanina tiene implicaciones para la virulencia criptocócica

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 849 (2023) Citar este artículo

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El hongo Cryptococcus neoformans es el agente causante de la criptococosis, una enfermedad que es uniformemente letal a menos que se trate con fármacos antimicóticos, aunque los regímenes actuales se ven obstaculizados por la toxicidad del huésped y la resistencia de los patógenos. Un enfoque alternativo atractivo para combatir esta enfermedad mortal es la orientación directa de los mecanismos de virulencia derivados de patógenos. C. neoformans expresa múltiples factores de virulencia que han sido estudiados previamente como entidades aisladas. Entre estos, se encuentran la ureasa, que aumenta el pH fagosomal y promueve la invasión cerebral, y la melanización, que protege contra las células inmunitarias y los tratamientos antifúngicos. Aquí informamos una interdependencia recíproca entre estos dos factores de virulencia. Las células que hidrolizan la urea liberan gas amoníaco que actúa a distancia para elevar el pH y aumentar las tasas de melanización de las células cercanas, lo que a su vez reduce la secreción de vesículas extracelulares que transportan ureasa. Esta relación recíproca se manifiesta como una propiedad emergente que puede explicar por qué ha sido difícil apuntar a mecanismos de virulencia aislados para el desarrollo de fármacos y aboga por un enfoque más holístico que considere el compuesto de virulencia.

Los factores de virulencia son rasgos que confieren a los microbios infecciosos la capacidad de dañar y persistir en huéspedes infectados a pesar de las respuestas inmunitarias1. Aunque los patógenos tienden a emplear múltiples factores de virulencia, incluidos recubrimientos superficiales, toxinas y enzimas, la mayoría de los estudios se centran en la contribución independiente a la patogenicidad de un solo factor sin tener en cuenta su contribución al compuesto de virulencia2. Los mecanismos por los cuales interactúan los factores de virulencia es un tema relativamente inexplorado en la patogénesis microbiana.

C. neoformans expresa un conjunto diverso de factores de virulencia que incluyen una cápsula de polisacárido, la producción de melanina y la expresión de varias enzimas como la ureasa y la fosfolipasa, entre otras. La cápsula de polisacárido y el pigmento de melanina protegen contra la fagocitosis y los estallidos oxidativos de las células fagocíticas, respectivamente3,4. La ureasa es una enzima nutricional, que incidentalmente interfiere con la acidificación fagosómica al hidrolizar la urea para generar amoníaco5 y juega un papel crucial en la invasión cerebral6,7, mientras que la fosfolipasa daña las membranas fagosómicas de los macrófagos y promueve la supervivencia intracelular8. Hay poca información sobre cómo estos factores de virulencia interactúan entre sí.

Este estudio caracteriza la interacción entre la actividad de la ureasa criptocócica y la melanización. La ureasa se libera en vesículas extracelulares e hidroliza la urea para producir amoníaco, que se muestra aquí para mediar la acción a distancia a través de su capacidad para viajar como gas. La reacción de melanización depende del pH y, por lo tanto, es promovida por una mayor producción de amoníaco por parte de la ureasa. Se descubrió que la melanización mejorada favorece la persistencia de las células criptocócicas dentro de los fagosomas y, por lo tanto, aumenta la diseminación cerebral a través de un mecanismo de caballo de Troya. El depósito de melanina en la pared celular actúa como un mecanismo de retroalimentación al reducir la producción de vesículas extracelulares para inhibir la liberación de ureasa asociada a vesículas. Por lo tanto, la ureasa y la melanina exhiben una modulación recíproca que brinda ventajas en diferentes etapas de la infección y esta coordinación y sinergia de los factores de virulencia da como resultado cambios fenotípicos que no podrían haberse anticipado al estudiar cada componente por separado.

Mientras analizamos la actividad de la ureasa de C. neoformans en caldo de urea rápido9, notamos que con un tiempo de incubación prolongado, los medios en pocillos sin células también aumentaron en pH (Fig. 1a, panel izquierdo). La medición de la absorbancia a 560 nm (A560) para cada pocillo reveló una relación lineal directa entre el cambio de color en el pocillo sin células y el número de células en el pocillo adyacente (Fig. 1a, panel derecho). Para determinar si este fenómeno dependía de la actividad de la ureasa, se cultivaron células de tipo salvaje (WT) o deficientes en ureasa (ure1∆) en caldo de urea en un pocillo de una placa de 24 pocillos junto con medio libre de células en el resto. 23 pozos. Después de la incubación a 30 ˚C durante 24 h, los medios en el pocillo que contenía células WT y varios pocillos circundantes cambiaron de color de amarillo a rosa mientras que no se observó cambio de color en la placa que contenía células ure1∆ (Fig. 1b, panel izquierdo). La relación sigmoidal entre A560 de medios libres de células y la distancia a las células WT que producen amoníaco (Fig. 1b, panel derecho) se parecía a una curva de titulación de pH para la cual el punto medio es el pKa. Un ajuste de la curva de Boltzmann de los datos da un valor de punto medio de 56 mm y sugiere que el pH de los medios en ocho pocillos dentro de esta distancia ha aumentado al menos a 7,9, el pKa de rojo fenol en caldo de urea. Con un detector de gas de amoníaco portátil con un rango de 0 a 200 ppm, se detectó amoníaco durante lecturas de 30 s para cultivos cultivados en caldo de urea durante 24 h a 30 ˚C con una densidad celular inicial mínima de 2 × 106 células/mL cuando la concentración de urea se mantuvo constante al 2 % (Fig. 1c, panel izquierdo) o con una concentración mínima de urea de 0,25 % y una densidad celular constante de 1 × 108 células/mL (Fig. 1c, panel derecho). En ambos casos, la cantidad acumulada de amoníaco producido durante 24 h fue considerablemente mayor, como lo demuestra el aumento del pH de los medios de cultivo a densidades celulares y concentraciones de urea aún más bajas (Fig. 1c).

a Fotografías en color (panel izquierdo) de pocillos que contienen caldo de urea con el número indicado de células de C. neoformans o sin células después de la incubación a 30 °C durante 2 o 6 h. La absorbancia a 560 nm (A560) de los medios sin células después de 6 h muestra un aumento lineal con el aumento del número de células en los pocillos adyacentes (panel derecho). b Placas que contenían caldo de urea en todos los pocillos y 1 × 108 células de tipo salvaje (WT) o ure1∆ en el pocillo superior izquierdo (A1) fotografiadas después de 24 h a 30 °C (panel izquierdo). Se observa una relación sigmoidal entre A560 y la proximidad al pozo A1 (panel derecho) para las células WT pero no para las células deficientes en ureasa. c Porcentaje máximo de A560 de sobrenadante de cultivo (rosa) y gas amoníaco (NH3, negro) medido para cultivos WT cultivados en caldo de urea a 30 °C durante 24 h con densidad celular inicial creciente (panel izquierdo) o concentración de urea creciente (panel derecho) . Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, exploramos cómo el amoníaco liberado por las células de C. neoformans afectaría a las células cercanas. Dado que la oxidación química de la dopamina ocurre más fácilmente a un pH alcalino de 10, postulamos que el aumento del pH debido a la producción de amoníaco podría promover la formación de melanina. De hecho, las células que crecen en agar suplementado con dopamina cerca de WT en comparación con las células ure1∆ en caldo de urea mostraron una mayor producción de pigmento de melanina que aumentó linealmente con la proximidad a la fuente de amoníaco (Fig. 2a). Como C. neoformans crece mejor a pH ácido de 11, la melanización se analiza de forma rutinaria en medios mínimos de pH 5,5. Cuando el pH del agar suplementado con dopamina se tituló de pH 5,5 a 7, la producción de pigmento aumentó significativamente de pH 6 a 6,5 ​​y de pH 6,5 a 7 (Fig. 2b). Esto sugiere que el aumento de la melanización observado en las células que crecen cerca de las células productoras de amoníaco fue el resultado del aumento del pH del agar de dopamina. Mientras que la producción de amoníaco por parte de las células WT que crecen en caldo de urea estimuló la melanización de las células cercanas que crecen en agar dopamina de pH 5,5, el ajuste previo de los medios a pH 7 produjo niveles comparables de pigmentación para las placas de control WT, ure1∆ y sin células (Fig. 2c, panel izquierdo). Después de 48 h a 30 ˚C, el pH del agar de dopamina aumentó significativamente solo en la placa que contenía células WT en caldo de urea, pero no para las placas que contenían ure1∆ o controles libres de células (Fig. 2c, panel derecho). También examinamos el efecto de la liberación de amoníaco sobre el crecimiento de C. neoformans en pozos cercanos y encontramos que el pH del medio aumentó proporcionalmente con el aumento de la proximidad a la fuente de amoníaco y cuando el pH aumentó a 8,5 o más, el crecimiento se vio afectado (Fig. 2d).

a Células WT de C. neoformans melanizadas durante 24 h a 30 °C en agar complementado con dopamina (DA) 0,1 (verde) o 1 mM (naranja) en presencia de células WT o ure1∆ en caldo de urea (paneles de la izquierda). La pigmentación cuantificada para tres réplicas biológicas revela un aumento neto lineal en la melanización con una mayor proximidad a las células WT productoras de amoníaco en comparación con el mutante deficiente en ureasa (panel derecho). b Las células WT melanizadas durante 48 h a 30 °C en agar suplementado con DA 1 mM muestran una pigmentación significativamente mayor a pH 6,5 y 7,0. n = 4, NS no significativo, ****p < 0,0001; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. c Pigmentación cuantificada (panel izquierdo) y pH del agar (panel derecho) después del crecimiento de WT C. neoformans a 30 °C durante 48 h en agar de pH 5,5 o 7,0 complementado con DA 1 mM adyacente a un pocillo que contiene WT o ure1∆ ( mut) células en caldo de urea o medios libres de células (neg). n = 4, NS no significativo, ****p < 0,0001; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. d Curvas de crecimiento de células que crecen a la distancia indicada de las células en caldo de urea. Representada gráficamente es la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. Se indica el pH de los sobrenadantes de cultivo medido al final del experimento. e Imágenes representativas (paneles superiores) de células WT, lac1∆ o lac2∆ cultivadas en agar suplementado con DA 1 mM cerca de células WT o ure1∆ en caldo de urea. En el gráfico se muestra el aumento neto de la pigmentación calculado restando las medidas de cada pocillo en una placa ure1∆ de las del pocillo correspondiente en una placa WT (panel inferior). n = 4, NS no significativo, ****p < 0,0001; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. f Imágenes de fluorescencia (GFP) y campo claro (BF) (paneles superiores) de células que expresan GFP-laccasa 1 después de la incubación a 30 °C durante 24 h en las columnas 2 a 6 de una placa de 24 pocillos que contiene células WT en caldo de urea en columna 1 (barra de escala = 5 µm). El pH de los sobrenadantes de cultivo aumentó con el aumento de la proximidad a las células que producen amoníaco (panel inferior izquierdo, graficado como media ± desviación estándar de 3 réplicas biológicas) y los niveles de fluorescencia de GFP fueron significativamente más altos en las dos columnas más cercanas a la fuente de amoníaco (panel inferior derecho). n = 3, NS no significativo, *p = 0,0154, **p = 0,0046; ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para determinar si el aumento de la pigmentación producido en respuesta al amoníaco era realmente atribuible a la producción de melanina por parte de C. neoformans o simplemente al aumento de la autopolimerización de la dopamina, que también es acelerada por el pH alcalino de 10, ampliamos nuestro análisis para incluir cepas mutantes defectuosas en la producción de melanina. En respuesta a la inanición de glucosa, C. neoformans expresa dos genes de lacasa, LAC1, el gen de lacasa principal, cuya deleción da como resultado un fenotipo albino12, y el homólogo 75% idéntico, LAC2, que se expresa a un nivel más bajo y tiene solo un defecto menor de melanización cuando se elimina13. Analizamos la melanización de las células WT, lac1∆ y lac2∆ en agar suplementado con DA en presencia de células WT o ure1∆ en caldo de urea y descubrimos que la estimulación de la producción de pigmento mediada por amoníaco se anuló para lac1∆ pero no para lac2∆ ( Figura 2e). Por lo tanto, la lacasa 1, la principal lacasa responsable de la melanización en C. neoformans, también es responsable de los efectos de la melanización relacionados con el amoníaco difusible.

Dado que la melanización catalizada por la lacasa 1 fue estimulada específicamente por el amoníaco producido por la ureasa, procedimos a investigar el impacto del gas amoníaco en la expresión y la localización celular de la lacasa 1. La expresión de una proteína de fusión GFP-laccasa 1 amino-terminal reveló que la enzima está mal localizada en vesículas citoplásmicas a pH ácido y se transporta a la pared celular a pH14 fisiológico. Cultivamos la cepa de expresión de GFP-laccasa 1 en todos los pocillos de una placa de 24 pocillos excepto en la primera columna vertical de pocillos, a la que se añadieron células WT en caldo de urea. Después de la incubación a 30 °C durante 24 h, la localización celular de GFP-laccasa 1 se visualizó mediante microscopía de fluorescencia de células vivas. Con una mayor proximidad a la fuente de amoníaco difusible, la GFP-laccasa 1 se dirigió cada vez más a la pared celular (Fig. 2f, paneles superiores) y esto se correlacionó con el aumento del pH de los medios de cultivo (Fig. 2f, panel inferior izquierdo). La medición espectrofotométrica de la fluorescencia de GFP reveló que las células en los pozos más cercanos a la fuente de amoníaco tenían significativamente más fluorescencia que las células más distantes (Fig. 2f, panel inferior derecho), lo que es consistente con una mayor expresión de GFP-laccasa 1 en respuesta a una mayor alcalinidad de los medios de cultivo.

Mientras que el amoníaco producido por la actividad de la ureasa promovió la melanización, la melanización a su vez disminuyó drásticamente la actividad de la ureasa (Fig. 3a). La melanización impide la captación de liposomas en las células15 y descubrimos que la pared celular melanizada imparte de manera similar una barrera para la liberación de vesículas extracelulares, como lo demuestra la menor fluorescencia de una sonda lipofílica en sobrenadantes de cultivo de células melanizadas en comparación con las no melanizadas (Fig. 3b). Para explorar el impacto de la melanización en el transporte vesicular más directamente, empleamos un método recientemente optimizado para el aislamiento de vesículas extracelulares de células cultivadas en medios sólidos16 para comparar los rendimientos de células no melanizadas y melanizadas. Tanto el contenido de lípidos como la actividad de la ureasa fueron significativamente más bajos para las preparaciones de vesículas de números comparables de células WT cultivadas en agar complementado con dopamina 1 mM en comparación con los medios mínimos solos (Fig. 3c). Para la cepa lac1∆ que no produce pigmento de melanina, el rendimiento de vesículas extracelulares y la actividad de ureasa fueron comparables para las células cultivadas en ausencia o presencia de dopamina (Fig. 3c). Por lo tanto, la melanina en la pared celular criptocócica impide el transporte vesicular desde las células y esto da como resultado una menor actividad de la ureasa porque la ureasa es uno de los factores de virulencia secretados en las vesículas extracelulares17. La actividad de ureasa disminuida de las células melanizadas en comparación con las no melanizadas también se manifestó en una disminución significativa en la cantidad de amoníaco liberado (Fig. 3d) y la capacidad de las células melanizadas para estimular la melanización de las células cercanas (Fig. 3e).

a La actividad de la ureasa medida como A560 de sobrenadantes de cultivo de caldo de ureasa a lo largo del tiempo fue significativamente mayor para las células no melanizadas (NM) en comparación con las células melanizadas (MEL) (panel izquierdo; n = 3, **p = 0,0045, ****p < 0,0001; ANOVA bidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak) para cultivos por triplicado con densidades celulares estadísticamente comparables (panel derecho; n = 3, NS no significativo; prueba t paramétrica de dos caras no pareada). b Disminución de la liberación de vesículas extracelulares de MEL en comparación con las células NM según lo medido por fluorescencia de la sonda lipofílica, 1, 6-difenil-1, 3, 5-hexatrieno (DPH), en sobrenadantes de cultivo. n = 5, ****p < 0,0001; Prueba t paramétrica bilateral no pareada. c El aislamiento de vesículas extracelulares de números comparables de células (panel izquierdo; n = 3, NS no significativo) cultivadas en placas de agar con medio mínimo (MM) o suplementado con dopamina (DA) produjo un contenido de lípidos significativamente más bajo (panel central; n = 3 , NS no significativo, ****p < 0,0001; prueba t paramétrica bilateral no pareada) y actividad de la ureasa (panel derecho; n = 3, NS no significativo, **p = 0,0074; prueba t paramétrica bilateral no pareada) prueba t) para células WT pero no para células lac1∆ cultivadas en presencia de DA. d Placas de 24 pocillos (izquierda) con células NM o MEL en caldo de urea en el pocillo A1 (arriba a la izquierda) y medios sensibles al pH en los pocillos restantes fotografiados después de la incubación a 30 °C durante 24 h. El diagrama de dispersión (derecha) de A560 para pozos dentro de los 50 mm (delineados con círculos) del pozo A1 indica una producción de amoníaco significativamente reducida para las células melanizadas. n = 7, ****p < 0,0001; Prueba t paramétrica bilateral no pareada. e Células WT cultivadas durante 18 h a 30 °C en agar suplementado con DA 1 mM en pocillos adyacentes a NM o MEL WT o células ure1∆ en caldo de urea (paneles de la izquierda). El gráfico (derecha) del aumento neto cuantificado en la pigmentación revela una estimulación significativamente mayor de la melanización por NM en comparación con las células MEL WT. n = 4, ****p < 0,0001; Prueba t paramétrica bilateral no pareada. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar el impacto del amoníaco producido por la ureasa durante la infección, se inocularon ratones con aproximadamente 5 × 105 células WT o ure1∆ mediante inhalación intranasal y se permitió que la infección prosiguiera durante 3 semanas. En este momento, los animales infectados con WT estaban notablemente moribundos en comparación con los ratones infectados con ure1∆, que parecían sanos. La comparación de la carga fúngica en los pulmones reveló un promedio de 6,1 × 108 unidades formadoras de colonias (CFU) para WT, que fue más de un orden de magnitud mayor que el promedio de 3,1 × 107 medido para ure1∆ (Fig. 4a). Para dos de los diez ratones infectados con células ure1∆, no se desarrolló una infección pulmonar productiva, por lo que estos animales se excluyeron de análisis posteriores. Los pulmones disecados de ratones infectados con WT eran significativamente más masivos en comparación con los pulmones recuperados de ratones infectados con ure1∆ (Fig. 4b). De acuerdo con el papel de la actividad de la ureasa en la diseminación cerebral6,7, la carga fúngica cerebral en ratones infectados por vía intranasal con ure1∆ fue aproximadamente cuatro logs más baja que en los pulmones, mientras que las CFU para ratones infectados con WT fueron en promedio solo unas 100 veces más bajas en cerebros en comparación con los pulmones (Fig. 4a).

a La infección intranasal resultó en una carga fúngica significativamente mayor tanto en los pulmones como en el cerebro de los ratones infectados con WT (n = 10) en comparación con ure1∆ (n = 8, pulmón; n = 6, cerebro). **** p < 0,0001; Prueba t paramétrica bilateral no pareada. b La masa pulmonar también fue significativamente mayor para los ratones infectados por vía intranasal con WT en comparación con ure1∆. n = 10, peso; n = 8, ure1∆, ****p < 0,0001; Prueba t paramétrica bilateral no pareada. c Niveles de amoníaco medidos en el exhalante de ratones infectados con WT o ure1∆ encerrados en un recinto de 55 cm3 durante 2 min. n = 7, ***p = 0,0001; Prueba t paramétrica bilateral no pareada. d El pH del tejido pulmonar medido con un electrodo de aguja MI-407 inmediatamente después de la disección y después de la homogeneización y centrifugación del tejido fue significativamente mayor para los ratones infectados con WT en comparación con ure1∆ (n = 10, WT; n = 8, ure1∆, ** p = 0,0036 y *p = 0,0358, respectivamente). e Imágenes representativas (paneles superiores) de secciones de tejido pulmonar teñidas con H & E de tres ratones infectados con WT o ure1∆ (flechas azules; barras de escala = 10 µm). Cuantificación del número total (panel inferior izquierdo; n = 3, *p = 0,0316; prueba t paramétrica bilateral no pareada) y porcentaje (panel inferior derecho; n = 3, *p = 0,0274; prueba t paramétrica bilateral no pareada) prueba t paramétrica) de células criptocócicas fuertemente melanizadas (flechas rojas) detectadas en secciones de tejido de tres animales infectados. f Imágenes de campo claro representativas de tres preparaciones independientes de partículas ricas en melanina aisladas de los pulmones de ratones infectados con células WT o ure1∆ después de hervir tejido homogeneizado en ácido clorhídrico concentrado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Postulamos que C. neoformans ureasa positiva produciría niveles detectables de amoníaco durante la infección pulmonar aguda. Al encerrar a los animales infectados en un pequeño recipiente hermético durante 2 min, se midió una lectura promedio de 1,1 ± 0,5 ppm de gas amoníaco en el aliento de los animales infectados con WT, en comparación con los ratones infectados con ure1∆ para los que el gas amoníaco era indetectable (Fig. 4c). A modo de comparación, se midió una lectura de amoníaco comparable de ~1,5 ppm para 2 × 106 células de C. neoformans que crecían en presencia de urea al 2% (Fig. 1c). Ampliamos nuestra investigación midiendo el pH de los pulmones infectados después de la disección sondeando el tejido con un electrodo de pH de aguja. Estas mediciones revelaron un pH significativamente más alto en los pulmones de WT en comparación con los ratones ure1∆ (Fig. 4d), lo que sugiere que los animales con ureasa positiva producen suficiente amoníaco para aumentar el pH del tejido infectado. Para controlar las posibles variaciones regionales del pH en todo el órgano, se homogeneizó el tejido pulmonar disecado en solución salina estéril y se midió el pH del sobrenadante libre de células resultante utilizando un electrodo de pH estándar. De acuerdo con las mediciones in situ, el pH de los homogeneizados de tejido pulmonar fue significativamente mayor para los derivados de WT en comparación con los animales infectados con ure1∆ (Fig. 4d). Nuestros resultados revelan una consecuencia previamente no anticipada de la infección por C. neoformans, a saber, que la actividad de la ureasa libera amoníaco gaseoso que altera el entorno celular del tejido infectado al aumentar el pH.

Dado que la melanización aumentó a valores de pH más altos in vitro (Fig. 2), planteamos la hipótesis de que el aumento del pH pulmonar dependiente de la ureasa promovería de manera similar la melanización in vivo. Desafortunadamente, las tinciones a base de plata no distinguen de manera confiable las células de C. neoformans melanizadas de las no melanizadas porque las tinciones también reaccionan con los polisacáridos en la pared celular18,19. A pesar de esta limitación, fue posible distinguir células de C. neoformans profundamente pigmentadas del tejido circundante en secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) de Galleria mellonella infectada20. De manera similar, pudimos detectar una pequeña cantidad de células muy melanizadas en secciones de tejido pulmonar teñidas con H & E de ratones infectados con WT o ure1∆ (Fig. 4e, panel superior). A medida que las capas de melanina se depositan progresivamente en la pared celular con el tiempo21, es probable que la cantidad de células fuertemente pigmentadas detectadas sea una subestimación representativa de la cantidad total de células melanizadas. Se identificó un número significativamente mayor de células melanizadas en secciones teñidas de tejido pulmonar que se habían infectado con WT en comparación con las células ure1∆ (Fig. 4e, panel inferior izquierdo). Para tener en cuenta la diferencia de 10 veces en CFU de pulmón para animales infectados con WT y ure1∆, se cuantificaron áreas de tamaño equivalente alrededor de cada célula melanizada para el número total de células criptocócicas. Este análisis reveló un porcentaje significativamente mayor de células melanizadas para WT en comparación con ure1∆ (Fig. 4e, panel inferior derecho). La melanina criptocócica es estable a los ácidos22 y detectamos partículas "fantasmas" de melanina resistentes a los ácidos características después de hervir muestras de tejido pulmonar durante 1 h en ácido clorhídrico concentrado (Fig. 4f) que eran aproximadamente 3 veces más abundantes para WT en comparación con ure1∆. El mayor número de WT melanizadas en comparación con las células ure1∆ en el tejido pulmonar infectado es consistente con nuestras observaciones in vitro de que la melanización fue promovida por la producción de amoníaco dependiente de ureasa.

Como la melanización aumenta la supervivencia de C. neoformans durante la coincubación con macrófagos4, buscamos extender este análisis infectando ratones por vía intravenosa con macrófagos que albergan células de C. neoformans no melanizadas o melanizadas. Medimos cargas fúngicas significativamente más altas en los pulmones y cerebros de animales 24 h después de la infección con células melanizadas en comparación con células no melanizadas (Fig. 5a). Esta observación respalda un modelo en el que las células melanizadas pueden persistir más tiempo en los fagolisosomas que las células no melanizadas. También comparamos infecciones con macrófagos que portaban células ure1∆ no melanizadas y melanizadas y, aunque las CFU fueron comparables en el tejido pulmonar, hubo una cantidad significativamente mayor de células melanizadas en comparación con las no melanizadas en el cerebro (Fig. 5b).

Carga fúngica cuantificada en los pulmones y cerebros de ratones 24 h después de la infección intravenosa con 2 × 105 macrófagos portadores de NM o MEL WT ((a) n = 4, *p = 0,0167 y 0,0300 para pulmón y cerebro, respectivamente; prueba t paramétrica de dos lados) o ure1∆ ((b) n = 5, NS no significativo, *p = 0,0414 para el cerebro; prueba t paramétrica de dos lados no pareada). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

C. neoformans ha desarrollado numerosas propiedades protectoras que promueven la supervivencia en hábitats como el suelo y la corteza de los árboles, donde protegen contra los depredadores ameboides23. Dadas las similitudes entre la ameba y los macrófagos en su interacción con este hongo24, muchos de estos también funcionan como factores de virulencia. Por ejemplo, la cápsula de polisacárido brinda protección contra la desecación en el medio ambiente y permite que las células criptocócicas eviten el ataque del sistema inmunitario del huésped25. Varios otros factores se secretan en vesículas extracelulares denominadas "bolsas de virulencia"17, incluida la ureasa, que hidroliza la urea para producir amoníaco26, y lacasa, que cataliza la oxidación de precursores fenólicos para producir melanina27. Los esfuerzos para tratar o prevenir la criptococosis se han centrado en gran medida en atacar uno de estos factores, por ejemplo, las vacunas basadas en los motivos del resto de azúcar de glucuronoxilomanano (GXM) de la cápsula28 o los anticuerpos generados contra la melanina29. A pesar de los esfuerzos concertados en estos frentes30, aún no se ha desarrollado una vacuna eficaz y los regímenes actuales de medicamentos antimicóticos no brindan una protección total31. Dada la naturaleza multifacética de la virulencia de C. neoformans, el desarrollo de estrategias exitosas de tratamiento o prevención de la enfermedad puede beneficiarse de un enfoque combinatorio que considere la posible interacción entre los factores de virulencia individuales.

La ureasa es una enzima ampliamente expresada en microorganismos que cumple una función nutricional para obtener nitrógeno a partir de la urea, al mismo tiempo que se duplica como factor de virulencia para muchas especies patógenas de bacterias, incluidas Helicobacter pylori, Proteus mirabilis y Klebsiella pneumoniae32,33,34 y hongos, como como C. neoformans y Coccidioides posadasii26,35. La conversión de urea en amoníaco por parte de estos microbios contribuye a la patogenia al provocar daños en los tejidos y amortiguar los entornos de pH bajo36. H. pylori produce suficiente amoníaco para que su presencia en el aliento humano se utilice para el diagnóstico de infección37. Detectamos una cantidad pequeña pero mensurable de gas amoníaco en el exhalador de ratones con una gran carga fúngica de células C. neoformans positivas para ureasa en sus pulmones, lo que establece la actividad de la ureasa durante la infección criptocócica. Se ha descubierto que el amoníaco actúa como una molécula de señalización capaz de alterar el crecimiento y los resultados del desarrollo de varias especies de hongos38,39,40. Por lo tanto, al considerar las acciones de la ureasa en virulencia, también es importante considerar las acciones de su producto, que puede difundirse a través de los tejidos para actuar de forma remota durante la patogénesis. Descubrimos un papel inesperado para la ureasa más allá de su función de modular el pH dentro de los fagolisosomas5, ya que su producto volátil, el amoníaco, aumenta el pH a distancia para reforzar la melanización de las células vecinas. El pH alcalino afecta la producción de melanina a través de un mecanismo multifacético, ya que promueve las reacciones químicas necesarias para polimerizar los precursores de melanina10 y también aumenta la expresión y localización de la pared celular de lacasa 1, la enzima que cataliza la reacción. Cuando comparamos el resultado de la infección murina con macrófagos que portaban células de C. neoformans melanizadas y no melanizadas, encontramos que la melanización aumentaba la invasión cerebral, probablemente al prolongar la supervivencia de las células criptocócicas en los macrófagos para promover la transmigración mediante un mecanismo de caballo de Troya. Nuestros hallazgos revelan cómo un mecanismo de virulencia que opera en una célula puede modular de forma remota la virulencia de las células vecinas, estableciendo un nuevo mecanismo para la comunicación intracelular de las células microbianas durante la infección.

Mientras que la ureasa promovió la melanización, las células melanizadas mostraron una liberación de amoníaco mediada por ureasa reducida. El crecimiento de C. neoformans en presencia de precursores de melanina no afecta la expresión de ureasa41, pero el depósito de melanina en la pared celular criptocócica reduce la porosidad de la pared celular42 y la permeabilidad de las células a los liposomas15. Encontramos que la melanización también impide la liberación de vesículas extracelulares desde el interior de las células, y dado que la ureasa se encuentra entre los factores de virulencia transportados en las vesículas, esto disminuyó la actividad de la ureasa en las células melanizadas. Dado que el crecimiento de C. neoformans se favorece a un pH bajo11 y se inhibe en condiciones alcalinas (Fig. 2d), la melanización reduce la liberación de vesículas que contienen ureasa que, a su vez, limita la producción de amoníaco para mantener el pH dentro del rango óptimo para el crecimiento. Proponemos un modelo mediante el cual la relación inversa entre la ureasa y la melanización proporciona un mecanismo de retroalimentación que proporciona a las células fúngicas un medio para ajustar rápidamente la actividad de la ureasa en respuesta a las condiciones ambientales cambiantes (Fig. 6).

La replicación de C. neoformans se ve favorecida a pH bajo, pero a medida que aumenta la densidad de población, también aumenta la liberación de gas amoníaco mediada por ureasa para producir un ambiente más alcalino. La combinación de una melanización mejorada y una replicación más lenta a un pH alto prolonga la persistencia de las células criptocócicas dentro de los fagosomas para aumentar la diseminación cerebral a través de un mecanismo de caballo de Troya. El depósito de melanina en la pared celular proporciona un mecanismo de retroalimentación al impedir la liberación de vesículas extracelulares que transportan ureasa para disminuir los niveles de amoníaco y restaurar el pH óptimo de crecimiento. Se espera que las tasas de crecimiento más rápidas aumenten la incidencia de la liberación lítica de los fagocitos para favorecer el paso de las células de levadura libres a través de la barrera hematoencefálica.

La interdependencia recíproca entre dos factores de virulencia, la actividad de la ureasa y la melanización, constituye una propiedad emergente en la patogénesis de C. neoformans que sirve para maximizar la supervivencia del hongo durante las variaciones temporales y espaciales que ocurren en el curso de la infección. Después de la inhalación, las células criptocócicas invasoras son engullidas por los macrófagos pulmonares y este encuentro tiene varios resultados posibles. La célula huésped puede matar a la levadura o las células fúngicas pueden sobrevivir y replicarse dentro de la célula huésped fagocítica, lo que conduce a una eventual exocitosis lítica o no lítica8. La ureasa juega un papel central en el resultado de esta interacción patógeno-huésped inicial, ya que la conversión de urea en amoníaco aumenta el pH fagosómico y disminuye las tasas de crecimiento intracelular para favorecer la persistencia de las células criptocócicas dentro de la célula huésped5. C. neoformans es inusual entre los hongos patógenos porque manifiesta un notable neurotropismo, de modo que la mayoría de los casos de criptococosis se presentan como meningoencefalitis. La infección cerebral diseminada requiere el paso de las células criptocócicas a través de la barrera hematoencefálica, ya sea como células de levadura libres o transportadas dentro de los macrófagos por un mecanismo de "caballo de Troya"43. Mientras que la ureasa juega un papel vital en la ruta anterior6,7, puede ser menos importante para la última ruta. Nuestros resultados sugieren que la melanización, en virtud de la prolongación de la supervivencia en los fagolisosomas, puede aumentar la frecuencia con la que las células se transportan al cerebro dentro de los macrófagos para compensar la pérdida de ureasa, al menos parcialmente.

En resumen, informamos que dos factores principales de virulencia de C. neoformans se modulan recíprocamente de manera que la ureasa produce amoníaco volátil que media los efectos en las células vecinas a través de la acción a distancia para aumentar el pH y, por lo tanto, promover la melanización, que a su vez reduce la actividad de la ureasa al inhibiendo la secreción de vesículas portadoras de la enzima. La modulación recíproca de la producción de melanina y ureasa, a su vez, produce células fúngicas con diferentes propiedades y resiliencias que pueden promover la supervivencia y la diseminación durante las diferentes fases de la criptococosis. Para los microorganismos que expresan múltiples factores de virulencia, es importante estudiarlos en el contexto de cada uno, ya que sus efectos combinados pueden no ser predecibles. De hecho, la intrigante posibilidad de interacciones adicionales entre factores de virulencia individuales en C. neoformans justifica futuras investigaciones. Por ejemplo, también se puede esperar que la ureasa afecte el crecimiento de la cápsula, ya que las células tienen cápsulas más grandes cuando se cultivan a pH 7 en comparación con pH 544. La relación interdependiente descrita aquí entre la producción de ureasa y melanina durante la infección criptocócica manifiesta propiedades emergentes que no son predecibles a partir de, ni reducible a sus funciones individuales conocidas. La coordinación entre los factores de virulencia individuales podría contribuir a que la virulencia sea una propiedad emergente a nivel de las interacciones huésped-microbio45 y el reconocimiento de esta complejidad debería guiar los esfuerzos futuros para abordar la virulencia microbiana.

Todos los procedimientos con animales se realizaron con la aprobación previa del Comité de uso y cuidado de animales (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins, con el número de protocolo aprobado MO21H124. El manejo de los ratones y la eutanasia con CO2 en una cámara adecuada se realizaron de acuerdo con las pautas sobre eutanasia de la Asociación Médica Veterinaria Estadounidense. La Universidad Johns Hopkins está acreditada por AAALAC International, de conformidad con las regulaciones de la Ley de Bienestar Animal y la Política del Servicio de Salud Pública (PHS) y tiene una Garantía de Bienestar Animal aprobada por el PHS con la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio de los NIH.

La cepa KN99α del serotipo A de Cryptococcus neoformans de tipo salvaje y el mutante por deleción de lacasa 1, lac1∆, se obtuvieron de la biblioteca de genes delecionados del Fungal Genetics Stock Center46. El mutante por deleción de lacasa 2, lac2∆ (RPC 26)13, se obtuvo de Joseph Heitman y J. Andrew Alspaugh (Duke University, NC). John Perfect (Duke University, NC) y Peter Williamson (NIH, MD) proporcionaron amablemente el mutante deficiente en ureasa, ure1∆26, y la cepa 14 de GFP-laccase 1, respectivamente.

WT o ure1∆ Células de Cryptococcus neoformans recuperadas de stocks congelados de glicerol al 50 % mediante crecimiento a 30 ˚C en medio de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) se subcultivaron en caldo de urea9 a la densidad celular especificada en la leyenda de cada figura y se transfirieron a el pocillo indicado de una placa de 24 pocillos. Después de cargar los pocillos restantes con caldo de urea libre de células, las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 30 °C durante el tiempo indicado. El cambio de color de los medios libres de células de amarillo a rosa fue una indicación de un aumento del pH como resultado del amoníaco que se difundió de las células que crecían en el caldo de urea. Las placas se fotografiaron con una cámara de 12 megapíxeles y se midió la absorbancia a 560 nm (A560) para cada pocillo sin células con el software Softmax Pro 7.1 con un lector de microplacas multimodo SpectraMax iD5 (Molecular Dynamics). A560 de un control de caldo de urea se restó de cada lectura. Se usó un método similar para comparar la difusión de amoníaco de células melanizadas y no melanizadas, excepto que las células WT se cultivaron previamente durante 6 días en medios mínimos (MM) compuestos por K2HPO4 29,4 mM, MgSO4 10 mM, glicina 13 mM, glicina 15 mM D-glucosa y tiamina 3 µM a pH 5,5 o MM suplementado con clorhidrato de dopamina 1 mM (DA, MilliporeSigma H8502) antes de ser subcultivado a una densidad de 5 × 107 células/mL en caldo de urea.

Las células WT se cultivaron en caldo de urea a 30 °C durante 24 h con la misma densidad celular inicial de 1 × 108 células/ml y un rango de concentraciones de urea o con una concentración de urea constante del 2 % y un rango de densidades celulares iniciales. . Se inoculó un cultivo de control de ure1∆ a una densidad celular de 1 × 108 células/mL en caldo de urea con 2% de urea. El sensor de un detector de gas de amoníaco BT-5800G con un rango de 0 a 200 ppm se mantuvo directamente sobre un tubo cónico de 1,5 ml que contenía 1 ml de cada cultivo durante 30 s y se registraron las lecturas. Las mediciones para cada cultivo WT se corrigieron restando la medición de fondo baja del control ure1∆ y luego se expresaron como un porcentaje del máximo de 200 ppm. Se midió el A560 de los sobrenadantes sin células recogidos por centrifugación a 2500 g durante 5 min, se restó la absorbancia de fondo del caldo de urea sin células y se expresó como porcentaje de la lectura máxima.

Se dispensó MM suplementado con DA 0,1 o 1 mM y agar al 1,5 % en los pocillos indicados de una placa de 48 pocillos y se dejó solidificar. Cada pocillo de agar suplementado con DA se sembró con 5 × 105 células WT lavadas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se cultivaron WT o ure1∆ en caldo de urea a una densidad celular de 5 × 107 células/mL en pocillos A1- A6 de la misma placa tal que se ensayó la melanización a una distancia de 13, 26, 39, 52, 65, 78 o 91 mm. Las placas envueltas en parafilm se incubaron a 30 °C durante 24 horas y luego se fotografiaron con una cámara de 12 megapíxeles. Las imágenes se convirtieron a imágenes en escala de grises con Adobe Photoshop y la intensidad de la pigmentación de cada mancha se cuantificó con el software Image Studio Lite 5.2 (Li-Cor Biosciences). Para derivar el aumento neto en la melanización impartida por la difusión de amoníaco, las mediciones de pigmentación para cada pocillo en una placa ure1∆ se restaron de las del pocillo correspondiente en una placa WT. Se usó una variación de este ensayo para comparar la melanización por WT, lac1∆ y lac2∆ en agar suplementado con DA 1 mM adyacente a un pozo que contenía WT o ure1∆ en caldo de urea como se describió anteriormente.

MM complementado con DA 1 mM, ácido ascórbico 5 mM (para minimizar la autopolimerización de DA que ocurre a pH alto) y un sistema de tampón universal que consta de Tris-HCl 20 mM, Bis-Tris 20 mM y acetato de sodio 20 mM, se ajustó al pH deseado y luego se mezcló con agar al 1,5 % y se distribuyó en los pocillos de una placa de 4 pocillos. El agar solidificado se colocó con 5 × 105 células WT lavadas con PBS y después de la incubación a 30 °C durante 48 h, las placas se fotografiaron y la pigmentación se cuantificó como se describió anteriormente. Se utilizó una variación de este ensayo para comparar la melanización en agar DA a pH 5,5 y 7,0 cuando un pocillo contenía caldo de urea suplementado con células WT o ure1∆ o medios sin células. El pH del agar en cada pocillo al final del experimento se midió utilizando tiras indicadoras de pH ColorpHast.

Se subcultivaron células WT C. neoformans por triplicado a una densidad de 1 × 105 células/mL en caldo YPD 0,25X en pocillos de una placa de 48 pocillos de 13, 26, 39 o 52 mm de pocillos que contenían 5 × 107 células en caldo de urea. La placa sellada con parafilm se incubó a 30 °C con agitación orbital continua en un lector de placas Spectromax iD5 y se leyó la absorbancia a 600 nm a intervalos de 15 min durante un período de 36 h.

Se recuperó una cepa de C. neoformans que expresaba lacasa 114 etiquetada con GFP a partir de una reserva de glicerol al 50 % congelada mediante crecimiento a 30 °C en medio de extracto de levadura-peptona-dextrosa (YPD) y luego se subcultivó en MM complementado con CuSO4 10 µM para 3 días a 30 °C. Las células se lavaron en medio fresco y luego se dispensaron en los pocillos de las columnas 2 a 6 de tres placas de 24 pocillos en las que se colocaron 8 × 107 células WT en caldo de urea en cada pocillo de la columna 1 y luego las placas se sellaron con parafilm. Después de la incubación a 30 °C durante 24 h, imágenes de campo claro y fluorescencia GFP (longitudes de onda de excitación y emisión de 488 y 520 nm, respectivamente) de células vivas de las columnas 2 a 6 (distanciadas 19,3, 38,6, 57,9, 77,2 o 96,5 mm de células que producen amoníaco) se capturaron usando el software QCapture-Pro 6.0 con una cámara CCD digital Retiga 1300 (Teledyne Photometrics, Tucson, AZ) en un microscopio Olympus AX70 (Olympus, Center Valley, PA) usando un microscopio objetivo de inmersión en aceite 100X. Las células de los 4 pocillos de cada columna se agruparon y centrifugaron durante 5 min a 2500 gy luego se midió el pH de los sobrenadantes del cultivo utilizando un medidor de pH accumet AB150 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Los sedimentos celulares se resuspendieron en 500 µl de medio y la fluorescencia se cuantificó usando longitudes de onda de excitación y emisión de 485 y 535 nm, respectivamente.

Células de C. neoformans WT cultivadas a 30 ˚C durante 4 días en MM o MM suplementado con DA 1 mM se lavaron con PBS y luego se subcultivaron por triplicado en caldo de urea a una densidad de 1 × 108 células/ml en caldo bien tapado. Tubos de 14 ml. Después de la incubación a 30 °C durante los tiempos indicados, las muestras de cultivo se filtraron a través de un filtro giratorio Costar Spin-X de 0,45 µm mediante centrifugación a 10.000 g durante 2 min y se midió el A560 de los filtrados libres de células. La densidad celular inicial de cada cultivo se determinó sembrando una dilución 10-6 de cada uno en agar Sabouraud dextrosa (SAB) y contando las unidades formadoras de colonias (CFU) después de la incubación a 30 °C durante 2 días.

Las vesículas extracelulares en el sobrenadante de cultivos de C. neoformans no melanizados y melanizados se cuantificaron utilizando la sonda lipofílica fluorescente, 1, 6-difenil-1, 3, 5-hexatrieno (DPH), como se describió anteriormente47. Se inocularon cinco cultivos biológicos replicados a una densidad celular de 1 × 108 células/mL en MM o MM suplementado con DA 1 mM y se incubaron durante 24 h a 30 °C antes de subcultivarlos en medios frescos que contenían 10 µg/mL de DPH. . Después de la incubación durante 24 h adicionales a 30 °C, se obtuvieron sobrenadantes libres de células mediante dos centrifugaciones secuenciales a 2500 g durante 5 min. La fluorescencia se cuantificó con longitudes de onda de excitación y emisión de 360 ​​y 430 nm, respectivamente, y las mediciones sin procesar se corrigieron restando la fluorescencia de fondo medida para los medios de control sin células.

Se aislaron vesículas extracelulares (EV) de células de C. neoformans cultivadas en medios sólidos utilizando un protocolo16 descrito anteriormente con las siguientes modificaciones. Las células WT o ∆lac1 recuperadas de stocks de glicerol al 50 % congelados mediante crecimiento a 30 °C durante 24 h en medio YPD se lavaron con PBS y luego se esparcieron 1 × 107 células en placas de medio sólido preparadas dispensando 20 ml de una solución 1:1. mezcla de agar al 3% y MM suplementado con urea 10 µM o MM suplementado con urea 10 µM y DA 1 mM. Después de la incubación a 30 °C durante 48 h, las células se recuperaron cuidadosamente de la superficie del agar utilizando un asa de inoculación estéril. Las células de 2 placas se suspendieron en un volumen total de 3 ml de PBS estéril para cada una de las 3 réplicas de cada variable. El número de células se cuantificó contando las diluciones de cada muestra utilizando un hemocitómetro. Después de la centrifugación a 4000 g durante 15 min a TA, los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos y se centrifugaron a 14 000 g durante 15 min a TA. Después de pasar por un filtro de 0,8 µm, los sobrenadantes libres de células se centrifugaron a 270 000 g durante 1 hora a 10 °C. Los sedimentos de EV se resuspendieron en 100 µl de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,0.

Los rendimientos relativos de EV se compararon mediante la cuantificación del contenido de ergosterol utilizando un kit de ensayo de colesterol Amplex RED (Invitrogen, A12216) siguiendo el protocolo proporcionado. Brevemente, se permitió que 25 µL de cada preparación de EV reaccionaran a 37 °C durante 30 min y luego se cuantificó la fluorescencia con longitudes de onda de excitación y emisión de 550 y 590 nm, respectivamente. Después de corregir las mediciones sin procesar mediante la sustracción de la fluorescencia de fondo medida para una reacción de control sin colesterol, se extrapoló la concentración de ergosterol (µg/mL) de una curva estándar de colesterol.

La actividad de la ureasa se cuantificó para 25 µL de cada preparación de EV mediante el método de Berthelot utilizando un kit de ensayo de actividad de la ureasa (Sigma, MAK120) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La absorbancia se leyó a 670 nm y la actividad de la ureasa (unidades/L) se calculó por extrapolación de una curva estándar de amoníaco usando la ecuación (muestra A670 – blanco A670) × n / (pendiente × t) donde n es el factor de dilución y, t es el tiempo y el blanco es el control del ensayo de tampón solamente.

Los estudios en animales se realizaron con ratones hembra C57BL/6 J (Mus musculus), de 5 a 7 semanas de edad (Jackson Laboratories) que se alojaron en una instalación con una temperatura ambiente objetivo de 22 ˚C y un rango aceptable de 19 a 25 ˚C. , una humedad ambiente objetivo del 42 % y un rango aceptable de 30 a 70 %, y un ciclo de 14,5 h de luz/9,5 h de oscuridad. Los ratones se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 50 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina y luego se infectaron por vía intranasal con ~ 5 × 105 células WT o ure1∆ en una solución salina estéril al 0,9 %. Las CFU para cada inóculo cuantificadas mediante diluciones seriadas en placa en agar SAB complementado con penicilina-estreptomicina (P/S) al 1 % fueron 5,8 × 105 y 6,3 × 105 para WT y ure1∆, respectivamente. El sexo de los animales modelo se eligió según los protocolos establecidos para infecciones por C. neoformans5,26 y no se considera que influya en el resultado de los experimentos.

Se retiró la punta cónica de un tubo de centrífuga de 50 ml (Fisher Scientific, 06-443-19) y se ajustó firmemente en el tubo el sensor de un detector de gas de amoníaco BT-5800G. Mientras estaban bajo anestesia con ketamina/xilazina (como se describió anteriormente), los animales que habían sido infectados con WT o ure1∆ durante 20 a 22 días se colocaron dentro del tubo con la tapa bien cerrada y se registraron las lecturas en el medidor de gas después de 2 min.

Los ratones infectados durante 20 a 22 días con WT o ure1∆ se sacrificaron mediante inyección intraperitoneal de una dosis letal de ketamina/xilazina (50 mg/kg para animales infectados con WT que ya estaban muy enfermos debido a una alta carga fúngica en los pulmones o 150 mg/kg). mg/kg para animales infectados con ure1∆). El tejido pulmonar infectado se expuso mediante disección y se sondeó con un electrodo de pH de aguja MI-407 (Microelectrodes Inc., NH) en combinación con un medidor de pH accumet AB150 y un electrodo de referencia Ag/AgCl. Los pulmones se pesaron utilizando una balanza analítica DeltaRange (Mettler Toledo AT261). El tejido pulmonar y cerebral homogeneizado en solución salina estéril al 0,9 % mediante el paso a través de un filtro de células de 100 µm se diluyó en serie y se sembró en agar SAB + P/S para cuantificar las CFU en cada órgano. También se centrifugaron muestras de tejido pulmonar homogeneizado a 10.000 g durante 5 min y se midió el pH del sobrenadante resultante utilizando un medidor de pH accumet AB150.

Las muestras de tejido pulmonar diseccionadas de tres ratones infectados con WT o ure1∆ se fijaron en formalina al 10 % tamponada neutra a 4 °C y luego se enviaron para análisis histológico a los Servicios de Tejidos Oncológicos de Johns Hopkins. Se montaron secciones delgadas (4 µm) cortadas de muestras incrustadas en parafina en portaobjetos Superfrost Plus. Después de desparafinar y enjuagar con PBS, las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y luego se escanearon.

El tejido de pulmón de ratón se homogeneizó en 3 ml de solución salina al 0,9 %, se mezcló con un volumen igual de ácido clorhídrico concentrado (12 N) y se calentó en un baño de agua a 95 °C durante 1 hora. Las muestras enfriadas se centrifugaron a 10 000 g durante 30 min y el material resistente a los ácidos se resuspendió en 200 µl de PBS. Los montajes húmedos se prepararon aplicando muestras de 8 µL en portaobjetos, se examinaron bajo iluminación de campo brillante con un microscopio Olympus AX70 con un objetivo de inmersión en aceite de 100X y las imágenes se capturaron con el software QCapture-Pro 6.0 con una cámara CCD digital Retiga 1300. A partir de tres portaobjetos cada uno, el número total de partículas fantasma de melanina identificadas fue de 29 y 8 para tejido pulmonar derivado de ratones infectados con WT y ure1∆, respectivamente.

Los macrófagos derivados de la médula ósea (BMDM) se extrajeron de ratones C57BL/6 J y se les permitió diferenciarse como se describió anteriormente5. Se permitió que las células se diferenciaran en medio BMDM que consistía en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS) al 10 %, aminoácidos no esenciales al 1 %, penicilina-estreptomicina al 1 %, GlutaMAX 2 mM, tampón HEPES al 1 %, tampón HEPES al 0,1 %. 2-mercaptoetanol y sobrenadante acondicionado con células L-929 al 20 % en placas de cultivo no tratadas de 100 mm (Corning, 430591) durante 6–7 días a 37 °C en CO2 al 9,5 %. Las células diferenciadas se lavaron con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y se separaron de las placas de cultivo mediante tratamiento con Cellstripper durante 10 min a 37 °C. Las células se lavaron en medio BMDM y se sembraron a una densidad de 5 × 105 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C en CO2 al 9,5 % durante 24 h. Células de C. neoformans WT o ure1∆ cultivadas durante 3 días a 30 °C en MM (no melanizado) o MM suplementado con DA 1 mM (melanizado) se lavaron en medio BMDM a una densidad celular de 5 × 105 células/mL y se opsonizó mediante incubación con 2 µg/ml de 18B7 mAb48 durante 30 min a temperatura ambiente. El medio de cada pocillo de BMDM se reemplazó con medio que contenía 1 × 106 células C. neoformans y se permitió que la infección prosiguiera durante 1 h a 37 °C. Los BMDM infectados se lavaron 3 veces con HBSS para eliminar las células de levadura libres y luego se lavaron en solución salina USP al 0,9% estéril. Se anestesiaron ratones C57BL/6 J hembra, de 5 a 7 semanas de edad (Jackson Laboratories) mediante inyección intraperitoneal de una mezcla de 50 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilazina, y se infectaron con BMDM cargados de C. neoformans mediante inyección retroorbital. de ~2 × 105 células. Las CFU para cada inóculo se cuantificaron lisando los BMDM en H2O estéril y sembrando diluciones en serie en agar SAB + P/S. Después de 24 h, los animales infectados se sacrificaron mediante inhalación de CO2 y los pulmones y cerebros disecados se homogeneizaron en PBS estéril pasándolos a través de un filtro de células de 100 µm. Se sembraron diluciones en serie de cada homogeneizado de tejido en agar SAB + P/S y se corrigieron los recuentos de CFU para detectar ligeras diferencias en CFU del inóculo.

Los datos se graficaron y analizaron para determinar su significación estadística usando el software GraphPad Prism 9. Cada punto de datos en los diagramas de dispersión indica una réplica biológica independiente y las líneas horizontales indican la mediana. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando pruebas t paramétricas bilaterales no pareadas para la comparación de dos conjuntos de datos o un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional ordinario con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para el análisis de más de dos conjuntos de datos (ns = no significativo , *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a los Servicios de Tejidos Oncológicos de Johns Hopkins por proporcionar imágenes histológicas expertas. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, subvención número R01-HL059842 (AC).

Departamento de Microbiología Molecular e Inmunología, Escuela de Salud Pública Johns Hopkins Bloomberg, Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21205, EE. UU.

Rosanna P. Baker & Arturo Casadevall

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RPB y AC concibieron el proyecto. RPB desarrolló la metodología, adquirió y analizó los datos y escribió el manuscrito. AC editó el manuscrito y la financiación adquirida.

Correspondence to Arturo Casadevall.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Agostinho Carvalho y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Baker, RP, Casadevall, A. La modulación recíproca de la producción de amoníaco y melanina tiene implicaciones para la virulencia criptocócica. Nat Comun 14, 849 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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Recibido: 18 Agosto 2022

Aceptado: 07 febrero 2023

Publicado: 15 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36552-7

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