Oxidación anaeróbica de propano acoplada a reducción de nitrato por un linaje dentro de la clase Symbiobacteriia

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6115 (2022) Citar este artículo

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Se cree que los microorganismos anaerobios desempeñan un papel fundamental en la regulación del flujo de alcanos gaseosos de cadena corta (SCGA, incluidos etano, propano y butano) desde los ecosistemas terrestres y acuáticos hacia la atmósfera. Se ha confirmado que el sulfato actúa como aceptor de electrones apoyando la oxidación anaeróbica microbiana de SCGA, sin embargo, varios otros aceptores energéticamente más favorables coexisten con estos gases en ambientes anaeróbicos. Aquí, mostramos que un biorreactor sembrado con biomasa de una instalación de tratamiento de aguas residuales puede realizar la oxidación anaeróbica de propano junto con la reducción de nitrato a gas dinitrógeno y amonio. El biorreactor estuvo en funcionamiento durante más de 1000 días y utilizamos experimentos de marcado con 13C y 15N, análisis metagenómicos, metatranscriptómicos, metaproteómicos y de metabolitos para caracterizar la comunidad microbiana y los procesos metabólicos. Los datos sugieren colectivamente que una especie que representa un nuevo orden dentro de la clase bacteriana Symbiobacteriia es responsable de la oxidación de propano dependiente de nitrato observada. El genoma cerrado de este organismo, que designamos como 'Candidatus Alkanivorans nitratireducens', codifica vías para la oxidación de propano a CO2 mediante la adición de fumarato y para la reducción de nitrato, con todos los genes clave expresados durante la oxidación de propano dependiente de nitrato. Nuestros resultados sugieren que el nitrato es un sumidero de electrones relevante para la oxidación de SCGA en ambientes anaeróbicos, lo que constituye un nuevo vínculo mediado por microbios entre los ciclos del carbono y el nitrógeno.

Una cantidad considerable de gas natural se genera a partir de sedimentos de aguas profundas y filtraciones de hidrocarburos en márgenes continentales y ecosistemas terrestres1,2. La mayor parte del gas natural liberado es consumido por microorganismos en zonas anóxicas antes de que el gas se difunda en ambientes óxicos y la atmósfera3,4,5. Los estudios de oxidación anaeróbica del gas natural se han centrado en el potente gas de efecto invernadero, el metano, como el componente más abundante (~60–90%)6,7. Sin embargo, los alcanos gaseosos de cadena corta (SCGA), incluidos el etano, el propano, el n-butano y el isobutano, también son constituyentes sustanciales del gas natural (hasta ~20 %)8 y son precursores importantes del ozono y los aerosoles orgánicos9. Las emisiones atmosféricas globales de SCGA se estiman en 9,2-9,6 Tg año-1 para el etano, 9,6-10,5 Tg año-1 para el propano, 10 Tg año-1 para el butano y 4,2 Tg año-1 para el isobutano10.

La oxidación anaeróbica del metano (AOM) se ha estudiado ampliamente y se comprende relativamente bien7,11,12,13,14,15,16,17. Las arqueas metanotróficas anaeróbicas (ANME) oxidan el metano a través de la vía de la metanogénesis inversa, incluido el complejo clave metil-CoM reductasa (MCR). El ANME transporta electrones del metano a bacterias sintróficas reductoras de sulfato (SRB)11,12 o directamente a la reducción de nitrato y óxidos metálicos13,14,15,16. La bacteria 'Candidatus Methylomirabilis oxyfera' realiza AOM a través de la vía de oxidación de metano "intraaeróbica" utilizando nitrito como único aceptor de electrones17. Es probable que los microorganismos también acoplen la oxidación de SCGA a la reducción de estos aceptores de electrones en condiciones anóxicas18. 'California. Se demostró que M. oxyfera' es capaz de oxidar etano y propano a través de la metano monooxigenasa, aunque aún no se ha demostrado si estas fuentes de carbono favorecen el crecimiento19. Hasta la fecha, el sulfato ha sido el único sumidero de electrones identificado para respaldar la oxidación anaeróbica de SCGA20,21,22,23,24,25. El aislado deltaproteobacteriano Desulfosarcina aeriophaga BuS5 oxida propano y butano a través de la vía de adición de fumarato generando succinatos sustituidos con alquilo, un proceso mediado por la alquilsuccinato sintasa (ASS)20,21, y reduce directamente el sulfato a sulfuro. Se descubrió que un enriquecimiento de la arquea 'Candidatus Syntrophoarchaeum' activaba el butano a través de la formación de butil-coenzima M, un proceso catalizado por un MCR divergente, con equivalentes reductores canalizados a socios SRB sintróficos23. De manera similar, la oxidación anaeróbica de etano se vinculó con 'Candidatus Argoarchaeum ethanivorans' relacionado, que también codificaba un complejo similar a MCR y se sugirió que formaba una relación sintrófica con SRB22. Sin embargo, aún no se ha identificado un archaeon capaz de mediar en la oxidación anaeróbica de propano directamente acoplada a la reducción de sulfato.

Al igual que el sulfato, el nitrato es un aceptor de electrones común en los ecosistemas naturales26 y es utilizado por ANME archaeon 'Ca. Methanoperedens nitroreducens' para AOM13. La reducción de nitrato acoplada a la oxidación de SCGA (Ec. (1), utilizando propano como ejemplo) también es más factible termodinámicamente en comparación con las reacciones de oxidación de SCGA acoplada a la reducción de sulfato (△Go'= −102 kJ/mol propano)20 , pero aún no se ha relacionado con ningún linaje microbiano.

Aquí combinamos pruebas de balance de masa y de electrones, experimentos de marcado con 13C y 15N, secuenciación de amplicón del gen 16S rRNA, análisis de metabolitos y enfoques multiómicos para proporcionar evidencia de que una nueva especie bacteriana dentro de la clase Symbiobacteriia realiza oxidación anaeróbica de propano acoplado a nitrato. reducción.

En este estudio, un biorreactor anaeróbico sembrado con biomasa de una planta de tratamiento de aguas residuales se alimentó con pulsos de propano y nitrato durante más de 1000 días. Los datos de rendimiento a largo plazo mostraron un consumo simultáneo de propano y nitrato, con acumulación de amonio, gas dinitrógeno y acumulación transitoria de nitrito (Figura complementaria 1). No se observó consumo de nitrato en las incubaciones de control (sin la adición de biomasa de cultivo de enriquecimiento o propano, Fig. 2 complementaria), lo que sugiere que la reducción de nitrato (a nitrito, amonio y N2) junto con el consumo de propano en el biorreactor fue mediada por microbios. Para confirmar la reacción de oxidación de propano anaeróbica dependiente de nitrato, y para verificar los productos finales de la misma, la biomasa del reactor original se incubó en experimentos por lotes con propano marcado con 13C (13CH313CH213CH3) y nitrato marcado con 15N (15NO3−) agregado a ~8 % y ~1% del total de propano y nitrato total, respectivamente. La cantidad de CO2 total y CO2 marcado con 13C aumentó, acompañado de una disminución en C3H8 y 13C3H8 (Fig. 1a, b). La relación (2,42) entre el 13CO2 total producido (46 μmol) y el 13C3H8 total consumido (19 μmol) estuvo cerca de la relación estequiométrica teórica de 3:1. El balance de carbono sugiere que el propano se oxidó con CO2 como producto final. El consumo total de NO3− (0,73 mmol) coincidió con la producción total combinada de N2 y NH4+ (0,8 mmol) (Fig. 1c). De manera similar, el consumo de 15NO3− (9,38 μmol) estuvo cerca del 15N en 29N2 (1,1–1,5 % del N2 total), 30N2 (0,03 % del N2 total) y 15NH4+ producido, que sumaron 9,71 μmol en combinación (Fig. 1d). Estos resultados confirmaron la reducción de nitrato a gas dinitrógeno y amonio. Los electrones generados a partir de la oxidación anaeróbica de propano (AOP, 5,03 mmol) estaban cerca de la demanda de electrones para la reducción de NO3− a N2 y NH4+ (5,15 mmol), lo que sugiere que los electrones generados por AOP se usaron para la desnitrificación y la reducción de nitrato disimilatorio a amoníaco (DNRA ), consistente con las siguientes reacciones27:

a Conversión de C3H8 a CO2, b 13C3H8 a 13CO2, c NO3− a NH4+ y N2 con formación transitoria de NO2−, d 15NO3− a 15NH4+ y 29N2 con formación transitoria de 15NO2−. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se realizaron experimentos estequiométricos tanto en el reactor principal como en incubaciones por lotes sembradas con biomasa del sistema principal, para establecer con mayor precisión los balances de nitrógeno y electrones. La reducción de nitrato/nitrito pareció ocurrir en dos etapas distintas (Fig. 2a). En la Etapa 1 (antes del agotamiento del nitrato), el nitrato se convirtió en nitrito y gas dinitrógeno con una producción de amonio insignificante. En la Etapa 2 (después del agotamiento del nitrato), tanto el gas dinitrógeno como el amonio se generaron a partir del nitrito acumulado en la Etapa 1. La observación de que el DNRA se produjo predominantemente cuando el nitrato se volvió limitante es consistente con estudios previos28,29,30. La relación entre el consumo de nitrato y el gas dinitrógeno y la producción de amonio en pruebas por lotes por triplicado (Fig. 2a, Fig. 3 complementaria) fue de 1,03 ± 0,05 (Fig. 2b, Tabla 1 complementaria), lo que sugiere que el nitrato finalmente se convirtió por completo en gas dinitrógeno ( 57,3 ± 5,5%) y amonio (42,7 ± 5,5%). La relación entre la producción de electrones (calculada a partir de la oxidación de propano a CO2) y el consumo de electrones (reducción de nitrato) fue de 1,10 ± 0,01 (Fig. 2b, Tabla complementaria 1), lo que sugiere que la reducción de nitrato fue el principal sumidero de electrones para la oxidación de propano.

a Perfil bioquímico típico de los sistemas (comenzado el día 1050) que muestra el consumo simultáneo de nitrato y propano con formación transitoria de nitrito y producción de gas dinitrógeno y amonio. La reducción de nitrato parecía ocurrir en dos fases distintas. En la Etapa 1, el nitrato se convirtió en nitrito y gas dinitrógeno con una producción de amonio insignificante; mientras que en la Etapa 2, tanto el gas dinitrógeno como el amonio se generaron a partir del nitrito acumulado. b Los balances promedio de nitrógeno y electrones se calcularon a partir de las tres pruebas por lotes (para obtener datos completos y cálculos, consulte la Tabla complementaria 1). Las barras de error representan errores estándar. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El perfilado de la comunidad con la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA reveló que un filotipo bacteriano perteneciente a un linaje no clasificado dentro del filo Firmicutes era la población más abundante en el biorreactor (20,1 % en el día 985, figura complementaria 4), a pesar de ser indetectable en el inóculo. Para obtener un genoma representativo de la población dominante, se realizó una secuenciación metagenómica de lectura larga (Nanopore) y corta (Illumina) (datos complementarios 1) en la biomasa del biorreactor muestreado el día 1040. El ensamblaje y la agrupación de los datos metagenómicos condujeron a la recuperación de 59 genomas casi completos (≥70% de integridad y ≤10% de contaminación según CheckM, Datos complementarios 1, Figura complementaria 5) incluidos 11 genomas circulares completos (Datos complementarios 1). La población más abundante se clasificó con la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB) para representar un nuevo orden dentro de la clase Symbiobacteriia del Phylum Firmicutes (22,8% de abundancia relativa, Tabla complementaria 2). Proponemos el nombre 'Candidatus Alkanivorans nitratireducens' para esta bacteria en base a su capacidad en la degradación de propano dependiente de nitrato (ver más abajo). El gen 16S rRNA (1536 pb) recuperado del 'Ca. El MAG de A. nitratireducens era idéntico a la abundante secuencia del amplicón del gen 16S rRNA afiliado a Firmicutes. La CA. El MAG de A. nitratireducens se completó y se circularizó con un tamaño de 2, 43 Mbp (Fig. 6 complementaria). Un árbol filogenético basado en el genoma mostró que el 'Ca. A. nitratireducens' era filogenéticamente distinta de Symbiobacteriia disponible públicamente (Fig. 3a). La identidad de nucleótidos promedio (ANI) y la identidad de aminoácidos (AAI) de la 'Ca. El genoma de A. nitratireducens, comparado con el de sus parientes más cercanos en GTDB, es decir, Symbiobacteriia ZC4RG38, Symbiobacterium sp003242675 y Symbiobacterium thermophilum (<75,0% y 53,8–55,2% para ANI y AAI, respectivamente), respalda la clasificación de 'Ca. A. nitratireducens' como un nuevo orden dentro de la clase Symbiobacteriia31. El árbol del gen 16S rRNA (Fig. 7 complementaria) también revela que el 'Ca. A. nitratireducens está filogenéticamente distante de otras Symbiobacteriia clasificadas (<84,1 % de identidad del gen 16S rRNA)31 y no tiene parientes cercanos en la base de datos Silva. Se diseñaron tres sondas FISH (SYMB-1018, SYMB-624 y SYMB-186) y se aplicaron individualmente a la biomasa del biorreactor para visualizar la morfología y la disposición espacial del 'Ca. Células de A. nitratireducens. El examen microscópico de la biomasa reveló flóculos difusos con las células que parecían estar incrustadas en una matriz similar a una sustancia polimérica extracelular. 'California. A. nitratireducens 'apareció como células incrustadas en forma de varilla (~ 0.5 µm × 1.5 µm) que a veces formaban agregados (hasta ~ 50 µm) y eran abundantes y relativamente uniformemente dispersas en los flóculos (Fig. 3b y Suplementario Fig. 8). La morfología y la disposición espacial de las células fueron consistentes para las tres sondas, lo que brinda confianza en su especificidad (Fig. 8 complementaria).

un árbol filogenético basado en el genoma. La CA. El genoma de A. nitratireducens de este estudio está resaltado en texto rojo. Los puntos negros y blancos representan valores de arranque >90 % y >70 %, respectivamente. Las barras de escala indican sustituciones de aminoácidos por sitio. b Una micrografía de fluorescencia compuesta del cultivo de enriquecimiento hibridado con la sonda FISH SYMB-1018 (Cy3, roja; dirigida a 'Ca. A. nitratireducens') y teñida con DAPI (azul; todas las células microbianas). 'California. Las células de A. nitratireducens aparecen de color magenta (azul + rojo). La barra de escala indica 20 μm. La imagen representativa se seleccionó en base a la evaluación visual de seis experimentos de hibridación separados. También se obtuvieron resultados consistentes de forma independiente con dos sondas adicionales dirigidas al 'Ca. Población de A. nitratireducens (Fig. 8 complementaria). c, d Expresión relativa de cada genoma y contigs no agrupados, y metabolismo microbiano de interés para los genomas en el biorreactor. Se calcularon las transcripciones totales por millón (TPM) para cada gen. Se muestran conjuntos de genomas con expresión general de TPM total > 1 % (c). La anotación KEGG se utilizó para identificar los ORF que codifican para las vías de desnitrificación (M00529) y reducción de nitrato disimilatorio a amonio (M00530) (d). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Anotación del 'Ca. El MAG de A. nitratireducens identificó genes para un complejo ASS que incluye dos AssD (secuencias de aminoácidos idénticas) y tres subunidades AssA (89.3–90.7% de similitudes en las secuencias de aminoácidos, Fig. 9 complementaria), que median el primer paso de la activación anaeróbica de SCGA mediante adición de fumarato20,32. Alineación de 'Ca. Las secuencias de aminoácidos AssA de A. nitratireducens con secuencias homólogas en la base de datos NCBI confirmaron la conservación de residuos de aminoácidos clave (Gly828 y Cys489 en AssA1, Gly501 y Cys169 en AssA2, Gly828 y Cys489 en AssA3, Fig. 10 complementaria), que son importante para la función de las enzimas que agregan fumarato33. Los análisis filogenéticos revelaron que AssA y AssD de 'Ca. A. nitratireducens 'es filogenéticamente distante de las enzimas de adición de fumarato (AssAD y BssAD) en las bases de datos NCBI y UniRef (Fig. 4c; Fig. 11 complementaria). Además, el 'Ca. El MAG de A. nitratireducens alberga todos los genes necesarios para la degradación adicional del propilsuccinato/isopropilsuccinato, incluidos los genes de metilmalonil-CoA mutasa (mcmA) para el reordenamiento del esqueleto de carbono, los genes de propionil-CoA carboxilasa (pccB) para la descarboxilación y los genes clave para beta-oxidación34,35 (Fig. 5; Datos complementarios 2). El acetil-CoA generado a partir de la beta-oxidación puede ingresar al ciclo del ácido tricarboxílico oxidativo (TCA) para la oxidación completa a CO2 o para la regeneración del fumarato para rondas posteriores de activación con propano (Fig. 5). La isobutiril-CoA podría oxidarse, a través de semialdehído metilmalónico, a propionil-CoA36, que podría utilizarse para regenerar fumarato a través de la vía de metilmalonil-CoA (Fig. 5). Los genes para la CO deshidrogenasa: acetil-CoA sintasa (CODH/ACS) y la ruta inversa de Wood-Ljungdahl (WL) se identificaron en 'Ca. A. nitratireducens', lo que sugiere que la oxidación terminal de acetil-CoA a CO2 puede estar mediada por CODH/ACS y la deshidrogenación paso a paso de las unidades C1 derivadas37,38 (Fig. 5; Datos complementarios 2; Tabla complementaria 3). Esta ruta WL para la producción de CO2 es consistente con la propuesta para el propano dependiente de sulfato que degrada Desulfosarcina aeriophaga BuS521. Actualmente, la Clase de Symbiobacteriia solo incluye 3 genomas en la base de datos GTDB y no hay modelos metabólicos disponibles para el metabolismo anaeróbico del propano. Por lo tanto, se requieren más estudios para construir modelos metabólicos para 'Ca. A. nitratireducens' para calcular los flujos de carbono para las vías TCA y WL y comprender cómo las células regulan estas dos vías.

a Los cromatogramas de iones parciales (transición iónica, m/z: 289 > 147,2) de los extractos de cultivo enriquecidos (n = 3, tomados en varios momentos) revelaron un pico en el tiempo de retención de 10,832 min, que coincidía con el pico del estándar de isopropilsuccinato . b Se observó un pico en el tiempo de retención de 11,078 min (transición iónica, m/z: 289 > 147,1), correspondiente al pico del estándar de propilsuccinato, para los extractos celulares del cultivo enriquecido (n = 3 en diferentes puntos de muestreo). c Relación filogenética de 'Ca. AssA (rojo) de A. nitratireducens a otros AssA y BssA en la base de datos del NCBI. Tres subunidades AssA (AssA123) encontradas en 'Ca. El MAG de A. nitratireducens formó un grupo separado. Los valores de Bootstrap >90% se muestran como puntos negros en los nodos de rama. La barra de escala representa las sustituciones de aminoácidos por sitio.

La CA. El cultivo de enriquecimiento de A. nitratireducens utilizó una alquilsuccinato sintasa para activar el propano a n- e iso-propilsuccinato. Acetil-CoA se produce después del reordenamiento del esqueleto de carbono, la descarboxilación y la beta-oxidación. La oxidación de acetil-CoA a CO2 está catalizada por enzimas implicadas en el ciclo oxidativo del ácido tricarboxílico o en la vía inversa de Wood-Ljungdahl (etiquetas moradas). 'California. A. nitratireducens' albergaba todas las enzimas involucradas en la desnitrificación (NapAB, NorB, NosZ, excepto NirS/K) y procesos DNRA (NapAB, NrfAH) (texto verde). Expresión génica normalizada para 'Ca. A. nitratireducens' se indica como TPM (total de transcritos por millón). El aumento del grosor de la línea muestra valores de expresión génica crecientes. Las enzimas marcadas en azul, verde, morado y negrita se identificaron total o parcialmente en los extractos de proteínas, mientras que el texto rojo indica que no se detectaron enzimas. Alquilsuccinato sintasa, Ass; acil-CoA sintetasa de cadena larga, FadD; metilmalonil-CoA mutasa, Mcm; propionil-CoA carboxilasa, Pcc; Succinato-CoA ligasa, Suc; succinato deshidrogenasa, Sdh; ácido tricarboxílico, TCA; CO deshidrogenasa: acetil-CoA sintasa, CODH/ACS; metilentetrahidrofolato deshidrogenasa, Mthfd; metilentetrahidrofolato reductasa, Mthfr; formiltetrahidrofolato deformilasa, Fthd; formiato deshidrogenasa, Fdh; ATPasa transportadora de H+ tipo F, ATP; NADH-quinona oxidorreductasa, Nuo; antiportador Na+ H+ multicomponente, Mnh; menaquinol, MKH2; menaquinona, MK; nitrato reductasa, Nap; citocromo c 552 nitrito reductasa, Nrf; óxido nítrico reductasa, ni; Óxido nitroso reductasa, Nos.

Los análisis metatranscriptómicos y metaproteómicos revelaron que los genes involucrados en las vías propuestas para la oxidación anaeróbica completa de propano a CO2 estaban altamente expresados en 'Ca. A. nitratireducens' y sus productos génicos correspondientes también se detectaron en extractos de proteínas después de la adición de propano (con formiltetrahidrofolato deformilasa y formiato deshidrogenasa como excepciones, Fig. 5; Datos complementarios 2), lo que indica 'Ca. A. nitratireducens jugó un papel activo en AOP durante las etapas 1 y 2. Una búsqueda en toda la biblioteca de metagenomas sugirió que ninguna otra población en el sistema codificaba genes conocidos vinculados a AOP, incluidos los genes para ASS20,32 y alquil-coenzima M reductasa22 ,23. La actividad relativa de las poblaciones microbianas coexistentes (que en conjunto representan del 14 al 22 % del total de lecturas del transcriptoma) también fue sustancialmente menor que la de 'Ca. A. nitratireducens '(64–83% del total de lecturas del transcriptoma, Fig. 3c). Estos resultados sugieren fuertemente que 'Ca. A. nitratireducens' fue responsable de AOP en el sistema.

Los extractos celulares de la biomasa de enriquecimiento se analizaron en busca de metabolitos clave de la vía de activación mediante espectrometría de masas de triple cuadrupolo de ultra alta sensibilidad. Los cromatogramas de iones totales indicaron un tiempo de retención idéntico para los estándares de propilsuccinato y los metabolitos extraídos (Fig. 12 complementaria). Se detectaron picos de masa correspondientes a los estándares de isopropilsuccinato (m/z: 289 > 147,2) y propilsuccinato (m/z: 289 > 147,1) en los extractos celulares (Fig. 4a, b). Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que 'Ca. A. nitratireducens activa el propano a través de la escisión del enlace CH homolítico en los átomos de carbono primarios y secundarios y, con la adición de fumarato, produce propilsuccinato e isopropilsuccinato. Además, el iso-propilsuccinato (5,96 nM) fue más abundante que el propilsuccinato (2,33 nM) en los extractos de cultivo, lo que sugiere que la activación del átomo de carbono secundario que genera iso-propilsuccinato es la ruta principal de oxidación del propano (Fig. 5).

La CA. El MAG de A. nitratireducens también contiene todos los genes necesarios para DNRA (Fig. 5; Tabla complementaria 4), incluida una nitrato reductasa (napAB) que cataliza la reducción de nitrato a nitrito, y citocromo c nitrito reductasas (nrfAH) responsables de reducir nitrito generado a amonio. Los resultados metatranscriptómicos revelaron que los genes napAB codificados por 'Ca. A. nitratireducens' se expresaron más en la Etapa 1 en relación con la Etapa 2, de acuerdo con la mayor concentración de nitrato en la Etapa 1 (Fig. 13a complementaria). Además, 'Ca. La nrfAH de A. nitratireducens se expresó en gran medida en la Etapa 2, donde se generó la mayor parte del amonio (Fig. 13b complementaria). Además, las subunidades catalíticas de nitrato reductasa (NapAB) y citocromo c nitrito reductasa (NrfA) también se identificaron en extractos de proteínas (Fig. 5; Tabla complementaria 4). Otros miembros de la comunidad también expresaron genes para vías disimilatorias de reducción de nitrato (desnitrificación y DNRA; Fig. 3d), pero a niveles sustancialmente más bajos en comparación con 'Ca. A. nitratireducens'.

La contribución de 'Ca. A. nitratireducens 'a la producción observada de gas dinitrógeno no está completamente claro dado que el representante cerrado MAG carece de una nitrito reductasa productora de óxido nítrico identificable (nirS / K). El MAG tiene el potencial anotado para los dos últimos pasos de desnitrificación; que codifica la óxido nítrico reductasa (norB) y la óxido nitroso reductasa (nosZD) para la conversión de óxido nítrico en gas dinitrógeno (Fig. 5; Tabla complementaria 4). Estos genes se expresaron altamente en ambas etapas y se detectaron en los extractos de proteínas (Tabla complementaria 4), lo que indica que este microorganismo está contribuyendo a la reducción del óxido nítrico a gas dinitrógeno. Estas observaciones sugieren que 'Ca. A. nitratireducens' puede utilizar un gen nuevo o una ruta nueva para la reducción de nitrito a óxido nítrico. De hecho, se ha informado que varios otros microbios, como Bacillus vireti y bacterias metilotróficas, producen óxido nítrico a pesar de que no albergan genes nirS/K39,40,41. También es posible que otros miembros de la comunidad contribuyan a la desnitrificación observada a gas dinitrógeno, o la reducción de nitrito a óxido nítrico. Sin embargo, la expresión de los genes nirS/K y otros genes de desnitrificación fue relativamente baja para todas las demás poblaciones (Fig. 3d), lo que sugiere que 'Ca. A. nitratireducens' fue responsable de la mayor parte de las transformaciones de nitrógeno y carbono en el sistema.

La identificación de un firmicute oxidante de propano anaeróbico expande la diversidad filogenética conocida de linajes microbianos que median la oxidación anaeróbica de SCGA en el medio ambiente, que se mostró previamente para miembros de Deltaproteobacteria y archaeal phylum Halobacteriota. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en identificar un microorganismo que media en la oxidación anaeróbica de propano dependiente de nitrato (n-DAPO). Dada la prevalencia del nitrato en varios ecosistemas naturales y diseñados, combinado con el aumento de las emisiones atmosféricas de propano debido a la producción de petróleo y gas natural42, el proceso n-DAPO no descrito anteriormente probablemente ocurre en entornos naturales, lo que representa un vínculo pasado por alto entre el ciclo global del carbono y el nitrógeno. . El proceso n-DAPO recién descubierto puede desempeñar un papel importante en la reducción del impacto negativo del propano en la calidad del aire y el clima, lo que justifica más investigaciones. Aunque el propano es un gas de efecto invernadero menos potente en comparación con el metano, puede reaccionar con el radical hidroxilo, lo que da como resultado una mayor producción de ozono9,43. Además, el propano contribuye a la formación de NO2 y nitrato de peroxiacetilo, dos importantes contaminantes del aire43. La identificación y caracterización de 'Ca. A. nitratireducens' contribuye a una mejor comprensión del papel de los microorganismos en la regulación de las emisiones SCGA.

Alkanivorans (al.ka.ni.vo'rans. NL neut. n. alkanum, alcano; L. pres. part. vorans, devorador; NL masc. n. Alkanivorans, un devorador de alcanos). nitratireducens (ni.tra.ti.re.du'cens. NL masc. n. nitras (gen. nitratis), nitrato; L. pres. part. reduces, convertir a un estado diferente; NL part. adj. nitratireducens, reducir nitrato). Este nombre implica un organismo capaz de consumir propano y reducir los compuestos relacionados con el nitrógeno.

Enriquecido a partir de una mezcla de lodos de digestión anaeróbica y lodos activados de una planta de tratamiento de aguas residuales en Brisbane, Australia.

Bacterias anaerobias, oxidantes de propano y reductoras de nitrato, típicamente observadas como células con forma de bacilo de aproximadamente 0,5 (diámetro) × 1,5 µm (longitud), a veces formando grupos. Mesófilo en términos de temperatura y pH (enriquecido a 22–25 °C y pH 7–8).

Sin un fácil acceso a los sedimentos en un ambiente rico en propano, como filtraciones de gas de aguas profundas o sedimentos de aguas termales, una mezcla de aproximadamente 100 ml de lodo de digestión anaeróbica y 50 ml de lodo activado de una planta de tratamiento de aguas residuales a gran escala ( Brisbane, Australia) como inóculo para el enriquecimiento del biorreactor. Las aguas residuales suelen contener una amplia gama de sustratos orgánicos que permiten el crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Además, también se podrían generar pequeñas cantidades de propano en los sistemas de digestión anaeróbica44. Presumimos que algunos microorganismos oxidantes de propano podrían estar presentes en tales sistemas. El inóculo se incubó en un biorreactor de 2,3 L con 1,84 L de medio sintético anóxico preparado como se describió anteriormente45, dejando un espacio de cabeza de 0,46 L. La presión parcial de propano en el espacio de cabeza se mantuvo entre 0,9 y 1,4 atm lavando periódicamente el líquido y el espacio de cabeza con agua pura. gas propano (99,99%, Coregas, Australia). Se inyectó helio manualmente en el espacio de cabeza para presurizar el reactor hasta 1,5 atm. El nitrato se alimentó por pulsos al reactor mediante inyección manual de solución madre concentrada (80 g NO3--N l-1). El biorreactor se mezcló continuamente con un agitador magnético (IKA, Labtek, Australia) a 400 rpm y se incubó a temperatura ambiente (22 ± 2 °C). El pH se controló entre 7 y 7,5 mediante la adición manual de solución anóxica de HCl 1 M. Cada 1 a 3 meses, se intercambiaron 200 ml del sobrenadante con medio sintético fresco. Se extrajo una muestra líquida (un ml) 2 o 3 veces por semana a través del puerto de muestreo del biorreactor y se filtró 0,22 μm (filtro de polietersulfona, Millex, EE. UU.) para la medición de nitrato, nitrito y amonio. Se tomó una muestra de gas (100 μL) del espacio de cabeza usando una jeringa hermética a gas (Hamilton, EE. UU.) 2 a 3 veces por semana para la medición de gas propano y dinitrógeno.

Para la determinación estequiométrica de la reducción de nitrato y la oxidación anaeróbica de propano, se midieron periódicamente las concentraciones de propano y nitrógeno en el espacio de cabeza del biorreactor de 2,3 L además de nitrato, nitrito y amonio desde el día 990 al 1000. Además, también se realizaron dos pruebas por lotes en Recipientes de vidrio de 650 mL con una submuestra de 500 mL de biomasa transferida anaeróbicamente desde el biorreactor de 2,3 L (Tabla complementaria 5). A continuación, la biomasa se lavó con gas argón (99,99 %, Coregas, Australia) durante 20 min para eliminar el propano disuelto en el líquido. Se añadieron aproximadamente 45 ml de gas propano al espacio de cabeza como único donante de electrones. Se establecieron como controles cultivos enriquecidos sin propano y medio sintético estéril con propano (Tabla complementaria 5). Cada ensayo por lotes se realizó por triplicado.

Para los experimentos de marcaje de isótopos, se transfirió anaeróbicamente una submuestra de 500 ml de biomasa del biorreactor a un recipiente de vidrio de 650 ml. La biomasa se lavó con gas propano puro (99,99 %, Coregas, Australia) durante 20 min. Se inyectaron aproximadamente 12 ml de propano marcado con 13C (13CH313CH213CH3, 99% de átomos de 13C, Sigma) en el espacio de cabeza a través del tabique. Se añadió aproximadamente 1 ml de solución madre de nitrato (10 g NL-1) que contenía ~1% de nitrato de sodio marcado con 15N (98% de átomos 15N, Sigma) para lograr una concentración de ~20 mg NL-1. Usando una jeringa hermética al gas, se tomaron muestras de gas periódicamente del espacio de cabeza (Hamilton, EE. UU.) y luego se inyectaron en viales lavados con helio (Exetainer, Reino Unido). Se recogieron muestras líquidas, se filtraron (0,22 μm) y se almacenaron a -20 °C hasta el análisis de 15NO3-, 15NO2- y 15NH4+. Para cuantificar el CO2 producido en la fase líquida, se inyectaron muestras sin filtrar en viales de Exetainer, se acidificaron con una solución de HCl 1 M y se equilibraron con el espacio de cabeza durante al menos 0,5 h antes de la determinación del CO2.

Las concentraciones de nitrato, nitrito y amonio en muestras filtradas se determinaron utilizando un analizador de inyección de flujo Lachat QuickChem8000 (Lachat Instrument, Milwaukee, WI). Las concentraciones de propano, nitrógeno y dióxido de carbono en el espacio libre se cuantificaron con un cromatógrafo de gases (GC, 7890 A, Agilent, EE. UU.) equipado con un detector de conductividad térmica y una columna empaquetada Shincarbon ST (2 m × 2,0 mm). El cromatógrafo de gases se hizo funcionar utilizando argón como gas portador (tasa de flujo, 28 mL min−1). Las temperaturas del horno, inyector y detector se mantuvieron a 220, 250 y 260 °C, respectivamente. Las concentraciones de propano, nitrógeno y dióxido de carbono se calcularon en base a una curva estándar externa.

Las muestras marcadas isotópicamente que contenían nitrato y nitrito se dividieron en dos submuestras iguales. Para una submuestra, las fracciones de nitrato y nitrito 15N se midieron con un espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS) Thermo Delta V después de la conversión a N2O46. Para la otra submuestra, se eliminó el nitrito utilizando ácido sulfámico al 4 % (peso/vol) en HCl47 al 10 %, y la fracción 15N en el nitrato restante se midió mediante IRMS. Luego se calculó la fracción de 15N en nitrito utilizando la ecuación: fracciones de 15N en (NO3− + NO2−) × cantidad total de (NO3− + NO2−) = fracción de 15N en NO3− × cantidad total de NO3− + fracción de 15N en NO2− × cantidad total de NO2−. Utilizando un método de microdifusión48,49, el amonio quedó atrapado en filtros GF/D (Whatman, Reino Unido) que luego se quemaron para el análisis isotópico utilizando IRMS. 29N2, 30N2, propano marcado con 13C y 13CO2 en muestras de gas se determinaron con un cromatógrafo de gases (7890 A, Agilent, Estados Unidos) acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolo (5957 C inert MSD, Agilent, Estados Unidos). El cromatógrafo de gases estaba equipado con una columna J&W HP-PLOT Q PT (30 m × 530 μm) y funcionaba con helio como gas portador (caudal de 5,58 ml/min). El horno se mantuvo a 45 °C durante 2 min y luego se calentó a una velocidad de 10 °C/min hasta 60 °C, donde se mantuvo durante 6 min. N2, CO2 y C3H8 se detectaron con un impacto de electrones (EI) de 70 eV utilizando el procedimiento de autoajuste estándar para la calibración de masas. La adquisición se realizó en cromatografía de iones totales (TIC) para identificación y en monitoreo de iones seleccionados (SIM) para monitorear señales m/z a 28, 29 y 30 Da (N2), 44 y 45 Da (CO2), 44 y 47 Da ( C3H8) con un tiempo de permanencia de 100 ms para cada señal. El procesamiento de datos se realizó mediante el programa Chemstation (Agilent, Estados Unidos).

Se tomaron muestras de biomasa (10 ml) del biorreactor de enriquecimiento cada 2 o 3 meses y se sedimentaron mediante centrifugación (8000 × g durante 10 min) para la extracción de ADN. El ADN se extrajo utilizando el kit FastDNA SPIN for Soil (MP Biomedicals, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las concentraciones de ADN se midieron usando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). La secuenciación de amplicones para los genes 16 S rRNA (regiones V6 a V8) se realizó con el conjunto de cebadores universales 926 F (5ʹ-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3ʹ) y 1392 R (5ʹ-ACGGGCGGTGTGTRC-3ʹ)50 en una plataforma Illumina MiSeq (Illumina, EE. UU. ) en el Centro Australiano de Ecogenómica (ACE; Brisbane, Australia). Los resultados de la secuenciación se procesaron utilizando QIIME250.

El ADN extraído el día 1040 (para el metagenoma inicial) y el día 1100 (para el metagenoma superficial) se secuenció a través de bibliotecas de extremos emparejados de lectura corta utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ADN Illumina Nextera XT y la plataforma NextSeq500 (Illumina, EE. UU.) en ACE , basado en el protocolo del fabricante. También se tomaron muestras para la secuenciación metagenómica superficial al mismo tiempo que las muestras para la secuenciación metatranscriptómica para garantizar que la comunidad microbiana fuera consistente con el metagenoma inicial (Fig. 14 complementaria). Las bibliotecas generaron 149 millones y 1 millón de lecturas en promedio para el metagenoma inicial y superficial, respectivamente (Datos complementarios 1). Los duplicados, adaptadores y bases de mala calidad en las lecturas generadas se eliminaron mediante ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) con el parámetro "–remove_dups–minlen 100" que llama internamente a FastQC (https://www.bioinformatics.babraham .ac.uk/projects/fastqc/), FastUniq-1.151, cutadapt 2.10 y Trimmomatic-0.3652.

La biomasa del reactor por lotes (día 1120) también se sometió a la secuenciación de lectura larga de Nanopore. El ADN se extrajo con el kit Qiagen PowerSoil Pro (Qiagen, Alemania) y se comprobó la calidad con una combinación del kit de ensayo Qubit 1x dsDNA HS en el fluorómetro Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) y el kit de alta resolución QIAxcel DNA en el sistema QIAxcel Advanced (Qiagen, Alemania). La preparación de la biblioteca se completó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se secuenció en un PromethION (Oxford Nanopore Technologies, EE. UU.). La llamada base se realizó con Albacore (https://github.com/Albacore/albacore), lo que resultó en 73 millones de lecturas con calidad > Q5. Entre ellos, 12 millones de lecturas superaron los 1000 pb con N50 de lectura de 6135 pb. Los adaptadores se recortaron con Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop).

Aviary (https://github.com/rhysnewell/aviary) se usó para el ensamblaje híbrido y el agrupamiento de lecturas cortas y largas, llamando internamente a varios ensambladores y herramientas de agrupamiento diferentes. Los resultados se verificaron manualmente con Bandage53. Los contenedores resultantes se organizaron utilizando DASTools 1.1.254. Los genomas recuperados se desreplicaron aún más utilizando el flujo de trabajo "desreplicado" en drep-3.2.255 con la configuración predeterminada, lo que resultó en un conjunto de genomas no redundantes que consta de 59 genomas de alta calidad. La cobertura de la información del genoma y otros detalles se vieron y verificaron manualmente utilizando IGV 2.11.156. La integridad y la contaminación de los genomas se verificaron utilizando CheckM v1.1.357. Las lecturas cortas recortadas de calidad se mapearon al conjunto MAG final y los contigs sin agrupar usando bowtie 2.3.4.3. Se eliminaron las asignaciones con una relación de longitud alineada sobre una lectura <75 % o identidad de la región alineada <97 %. La abundancia de cada MAG se perfiló utilizando CoverM 0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) con solo mapeos primarios de calidad. NGA50 y otras características del genoma se calcularon utilizando el paquete BioSut de Python (https://github.com/jlli6t/BioSut).

Para todos los MAG y contigs no agrupados, se llamaron marcos de lectura abiertos (ORF) y la anotación primaria de los genomas se realizó utilizando Prokka 1.14.558 con el dominio inferido de la clasificación GTDB-Tk. Se realizaron búsquedas en la base de datos HMM de KEGG Orthology (consultada en julio de 2021) utilizando kofamscan 1.3.059, seleccionando el resultado principal para cada gen con valor e <1e-10 y medida F máxima. UniRef10060 (consultado en marzo de 2020) se indexó con la base de datos de taxonomía del NCBI y se buscó utilizando diamond61 v2.0.11.149 con 'blastp-sensible'. Se seleccionó el resultado superior con valor e <1e-5 e identidad > 30 y se asignó a la base de datos de ortología KEGG. Se buscó en la base de datos eggNOG v5 usando emapper 2.1.5 en modo diamante. Los motivos conservados presentes en los genes predichos relacionados con la oxidación del propano y el metabolismo del nitrógeno se verificaron aún más mediante la búsqueda de dominios conservados del NCBI62. Se usaron números KO anotados para inferir la ruta codificada en cada genoma. Las vías se identificaron como "no expresadas" si los bloques perdidos > 75 % cuando el total de bloques > 5, o los bloques perdidos > 1 cuando el total de bloques ≤ 5.

Se construyó un árbol del genoma bacteriano utilizando la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB r202) y se recuperaron los genomas bacterianos con un conjunto concatenado de 120 genes marcadores conservados específicos de bacterias deducidos de los genomas. Brevemente, los genes marcadores en los genomas se identificaron usando Prodigal 2.663 y se alinearon usando HMMER 3.364. Los árboles se infirieron utilizando FastTree 2.1.1165 con modelos WAG + GMMA. El bootstrapping se realizó utilizando GenomeTreeTk v0.1.6 (https://github.com/dparks1134/GenomeTreeTk) con un bootstrapping no paramétrico 100 veces mayor. Los árboles se visualizaron utilizando ARB 6.0.666 y se importaron a Adobe Illustrator (Adobe, EE. UU.) para su posterior perfeccionamiento. La clasificación de los genomas se determinó utilizando el flujo de trabajo 'classify_wf' en GTDB-Tk v1.5.167.

Los genes 16S rRNA se identificaron en el 'Ca. MAG de A. nitratireducens y genomas de Symbiobacteriia disponibles públicamente en la base de datos. Estos genes se compararon con la base de datos SILVA 138 SSU. Las secuencias seleccionadas y las secuencias del gen 16S rRNA previstas se desreplicaron utilizando cd-hit 4.8.168. En total, se recolectaron y alinearon 112 secuencias de ARNr 16S usando SSU-align v0.1.169. El árbol filogenético se infirió usando FastTree 2.1.1165 con parámetros '-gtr -gamma'.

Para análisis filogenéticos de AssA en 'Ca. A. nitratireducens', 24 secuencias de proteína AssA y BssA de referencia, de más de 700 aminoácidos (los números de acceso de las secuencias de referencia se proporcionan en la Tabla complementaria 6), se descargaron de bases de datos públicas y se alinearon usando muscle 3.8.3170 con el parámetro '-diags1 - maximetros 5'. Las brechas en msa se recortaron utilizando trimAI 1.4.171. El árbol filogenético se infirió utilizando FastTree 2.1.1165. Para la construcción del gen 16S rRNA y los árboles de aminoácidos AssA, el cálculo del valor de arranque y la visualización del árbol se realizaron según la construcción del árbol del genoma.

Se realizaron pruebas por lotes por triplicado el día 1100 en tres recipientes de vidrio de 650 ml con una submuestra de 500 ml de biomasa en cada recipiente. La reducción de nitratos en biorreactores se dividió en dos etapas. En la Etapa 1, el nitrato se convirtió principalmente en nitrito y gas dinitrógeno con una producción insignificante de amonio, mientras que en la Etapa 2 se produjeron tanto amonio como gas dinitrógeno. Para la co-extracción de ARN y ADN total, se recolectaron 10 mL de un cultivo activo enriquecido de cada lote de prueba en cada etapa y se conservó agregando solución RNAlater (Sigma-Aldrich) y se dejó reposar a temperatura ambiente por 1 h. A continuación, la mezcla se filtró a través de un filtro de nitrato de celulosa esterilizado (0,20 μm; Sartorius; Göttingen, Alemania). Para capturar los microorganismos que pueden pasar a través del filtro de 0,2 μm, el filtrado se concentró aún más usando un Amicon® Ultra Filter (Sigma-Aldrich) con un límite de peso molecular de 100 K. ARN y ADN totales en el filtrado concentrado y el filtro de nitrato de celulosa luego se extrajeron utilizando el kit de ARN total RNeasy Powersoil con el kit de elución de ADN RNeasy PowerSoil (Qiagen, Alemania) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se eliminó trazas de ADN genómico de los extractos de ARN con un kit Turbo DNA-free (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), seguido de un kit RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research, EE. UU.). El kit TruSeq Total RNA Library Prep with Ribo-Zero Plus se utilizó para la preparación de bibliotecas de ARN siguiendo el protocolo del fabricante. La biblioteca se secuenció en una plataforma NextSeq500 (Illumina, EE. UU.) en ACE (Brisbane, Australia) en 2 × 75 ciclos de ciclos emparejados (Tabla S1).

Las lecturas generadas se recortaron con ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) con el parámetro "–remove_adap –minlen 60". Se construyó una base de datos de rRNA a partir de arqueas y bacterias 5 S rRNA de 5SRNAdb72, la base de datos SSU de SILVA73 v138 y la base de datos LSU de SILVA v132. Las lecturas similares al ARN ribosómico se eliminaron utilizando SortMeRNA 4.2.074 con la configuración predeterminada y la base de datos construida como se indicó anteriormente. Las lecturas recortadas de calidad se asignaron a un conjunto MAG desreplicado y andamios no agrupados usando bowtie2. Se eliminaron las alineaciones con una longitud alineada <95 % de la longitud de lectura o una identidad <97 %. La posible contaminación de ADN de las bibliotecas de ARN se identificó utilizando RNAdir (https://github.com/jlli6t/RNAdir), una versión modificada de dirseq (https://github.com/wwood/dirseq). A continuación, se realizó una prueba binomial utilizando la función scipy.stats.binomtest. Se utilizaron mapeos para el cálculo de TPM (transcripciones totales por millón)75. Los niveles de expresión total de cada genoma se calcularon como la suma de TPM de todas las secuencias de codificación dentro de cada genoma.

Para la extracción de proteínas, se sedimentaron por centrifugación (18 000 × g, 4 °C) 10 ml de cultivo de enriquecimiento recolectado de las pruebas por lotes de transcriptómica, se lavó con 1 × PBS y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Los sedimentos celulares se lisaron en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 5 %, se incubaron con ditiotreitol 20 mM (concentración final) a 70 °C durante 60 min y luego se enfriaron a temperatura ambiente, seguido de alquilación con yodoacetamida 40 mM (concentración final) en la oscuridad durante 30 min. Posteriormente, se añadieron ácido fosfórico al 1,2% (concentración final) y seis volúmenes de tampón de unión S-Trap (metanol al 90%, concentración final de bicarbonato de amonio 100 mM, pH 7,1). La proteína total se digirió en una columna S-Trap Micro Spin (ProtiFi, Huntington, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante76. Brevemente, la solución de proteína se cargó en el filtro S-Trap y se centrifugó a 4000 g hasta que pasó toda la solución. El filtro se lavó tres veces con 150 μl de tampón de unión S-Trap y se digirió con 1 μg de tripsina de grado secuencial a 47 °C durante 1 hora. Los péptidos digeridos se eluyeron secuencialmente utilizando 40 µl de bicarbonato de amonio 50 mM, ácido fórmico acuoso al 0,1 %, acetonitrilo al 50 % y ácido fórmico al 0,1 % en H2O. Las soluciones de péptido se secaron antes de resuspenderse en 20 µl de acetonitrilo al 5% en H2O. Los péptidos se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) usando un sistema Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-LC acoplado a un espectrómetro de masas Q-ExactiveTM HX Hybrid Quadrupole-OrbitrapTM (Thermo ScientificTM). Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron buscando en los metagenomas anotados de 'Ca. A. nitratireducens' en Thermo Proteome Discoverer (versión 2.2.0.388). Las proteínas identificadas contenían al menos 1 péptido único con un límite de rigurosidad de tasa de descubrimiento falso (FDR, valor q) inferior a 0,05.

Para la preparación del extracto del metabolito, se recolectaron 5 mL de cultivo de enriquecimiento del biorreactor. Las células se recogieron por centrifugación (8000 × g, 10 min, 4 °C) y luego se resuspendieron en 1 ml de una mezcla de acetonitrilo-metanol-agua (4:4:2, vol/vol/vol) en tubos de matriz de lisis (MP Biomedicals ) con cuentas de vidrio. Las células se lisaron usando un homogeneizador basado en perlas operado durante 5 ciclos de agitación recíproca a baja velocidad (3000 rpm, 50 s) con enfriamiento en hielo (15 s) entre los pasos de homogeneización. Los extractos se separaron de los restos celulares y las perlas de vidrio mediante centrifugación a 18 000 g durante 10 min a 4 °C y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

Los estándares sintetizados personalizados (succinato de propilo e isopropilo, Best of Chemicals, EE. UU.) y los extractos celulares se secaron en un concentrador de vacío rotatorio (Concentrator Plus, Eppendorf) y luego se derivatizaron en 20 μL de cloruro de metoxiamina (30 mg/ml en piridina) con mezcla continua durante 2 h a 37 °C. Luego se añadió N,O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA, 20 µL) que contenía trimetilclorosilano (TMCS) al 1%. Las muestras se incubaron con agitación continua durante 30 min a 37 °C y luego se analizaron con un sistema GC/MS-TQ8050 de triple cuadrupolo de ultra alta sensibilidad (Shimadzu, Japón). El sistema GC se equipó con una fuente de ionización EI y se operó en modo de monitoreo de reacción múltiple (MRM) para la detección de compuestos. Se utilizó helio como gas portador a un caudal constante de 1,0 ml/min. Se inyectó un microlitro de la muestra derivatizada en un inyector PTV en modo split 1:10 con una temperatura de inyección de 280 °C. Las separaciones se llevaron a cabo en una columna DB-5ms (95% polidimetilsiloxano, 30 m × 0,25 mm × 1 μm) (Agilent JW Scientific). La temperatura del horno se mantuvo inicialmente durante 1 min a 120 °C, luego se aumentó a 220 °C a una velocidad de 8 °C/min y finalmente se aumentó a 320 °C a 50 °C/min y se mantuvo durante 1 min. La temperatura de la fuente de iones se fijó en 200 °C. Los parámetros espectrométricos de masas específicos se adaptaron para cada compuesto para monitorear los iones de fragmentación para cada analito (consulte la Tabla complementaria 7). Se nominaron dos fragmentos de iones de la fuente de iones EI y luego se fragmentaron más en la celda de colisión. Se eligieron los tres transitorios más abundantes para monitorear. El transitorio 1 se utilizó como cuantificador y los otros dos como calificadores.

FISH se realizó esencialmente como se detalla por Daims, et al.77. La biomasa del biorreactor se fijó con paraformaldehído al 4% (p/v) y se almacenó en etanol al 50% en PBS a -20 °C. Las sondas FISH se diseñaron utilizando el software ARB70 contra la versión 13873 de la base de datos Silva SSU Ref NR99, incluidas las secuencias relevantes generadas a partir del biorreactor de enriquecimiento. En ausencia de secuencias relacionadas en la base de datos (>92 % de similitud), las sondas se diseñaron frente a la secuencia 16 S de 'Ca. A. nitratireducens' y se debe tener cuidado en su aplicación más allá de los sistemas bien caracterizados. Dado que no hay representantes cultivados disponibles para la validación de la sonda, se diseñaron tres sondas FISH para apuntar a diferentes sitios en el 'Ca. 16 S rRNA de A. nitratireducens para dar una mayor confianza en su especificidad. Estos incluyeron el SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T - 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ - TTC GCA AGC ACT CCC GCA - 3ʹ) y SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC - 3ʹ ) sondas. Se diseñaron sondas auxiliares sin etiquetar78 para apuntar a las regiones flanqueantes de cada sitio de la sonda para aumentar la accesibilidad al sitio objetivo para obtener una señal fluorescente óptima (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Las sondas auxiliares se aplicaron en cantidades equimolares con su respectiva sonda. Los extremos 5' y 3' de las sondas FISH de oligonucleótidos se marcaron con el fluoróforo Cy3 y fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Singapur. Se logró una señal más alta para estas sondas FISH con pretratamiento con lisozima de la biomasa (0,5 mg ml−1 en EDTA 0,05 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 8) durante 30 min a temperatura ambiente. La sonda sin sentido Non-EUB se utilizó como control de hibridación negativo79. La tinción de las células con DAPI (1 ng/µl) se realizó durante 15 min en la oscuridad. La biomasa marcada se visualizó con un microscopio confocal láser de luz blanca Stellaris5 (Leica, Alemania).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación se archivan en la base de datos del NCBI con el número de proyecto PRJNA802347. Todos los borradores de secuencias de nucleótidos del genoma se han enviado al NCBI con los números de acceso SAMN25643198 a SAMN25643256. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD031366. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a A. Oren (Universidad Hebrea de Jerusalén) por sus sugerencias sobre la denominación de 'Ca. A. nitratireducens', G. Talbo y L. Liu por su ayuda con la extracción de proteínas y el análisis de datos de proteómica, Y. Wang y C. Lai por su asistencia con la operación del biorreactor, X. Zhang y S. Hu por el mantenimiento del cromatógrafo de gases, N. Clayton, N. Dawson y J. Li por los análisis químicos, A. Tabrett y A. McInnes por la ayuda para optimizar las sondas FISH y E. Larsen por la ayuda con la edición. JL cuenta con el apoyo de la Beca de Capacitación en Investigación de la UQ. JG, SM y GT cuentan con el apoyo de las becas futuras FT170100196, FT190100211 y FT170100070 del Australian Research Council (ARC), respectivamente. ZY cuenta con el apoyo de ARC Australian Laureate Fellowship (FL170100086).

Estos autores contribuyeron igualmente: Mengxiong Wu, Jie Li.

Centro Australiano de Biotecnología Ambiental y del Agua, Facultad de Ingeniería, Arquitectura y Tecnología de la Información, Universidad de Queensland, Santa Lucía, Queensland, Australia

Mengxiong Wu, Jie Li, Zhiguo Yuan y Jianhua Guo

Centro de Investigación del Microbioma, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Tecnológica de Queensland (QUT), Instituto de Investigación Traslacional, Woolloongabba, QLD, Australia

Andy O. Leu, Gene W. Tyson y Simon J. McIlroy

Centro de Investigación de Biogeoquímica Costera, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Southern Cross, Lismore, NSW, Australia

Dirk V. Soldados

Metabolomics Australia (Nodo de Queensland), Instituto Australiano de Bioingeniería y Nanotecnología, Universidad de Queensland, Santa Lucía, QLD, 4072, Australia

Tierra Stark

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JG concibió el estudio. MW, JG y SM planearon los experimentos. MW enriqueció los microorganismos en el biorreactor y realizó experimentos de balance de masas y electrones y etiquetado de isótopos. DE llevó a cabo las mediciones de nitrógeno isotópico. TS estableció métodos para el análisis de isótopos de carbono y metabolitos. SM diseñó sondas FISH y realizó microscopía FISH. MW realizó el muestreo, la conservación, el ADN, el ARN y las extracciones de proteínas para la secuenciación metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica. MW, JG y ZY realizaron el análisis de datos del proceso. JLAL, MW, GT, SM y JG realizaron el análisis de la comunidad microbiana y el análisis bioinformático. MW, JL, ZY, SM y JG escribieron el manuscrito en consulta con todos los demás autores.

Correspondencia a Simon J. McIlroy o Jianhua Guo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Florin Musat y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Wu, M., Li, J., Leu, AO y col. Oxidación anaeróbica de propano acoplada a reducción de nitrato por un linaje dentro de la clase Symbiobacteriia. Comuna Nacional 13, 6115 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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Recibido: 12 Abril 2022

Aceptado: 05 de octubre de 2022

Publicado: 17 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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