Un biosensor electroquímico portátil para el seguimiento de metabolitos y nutrientes

Nature Biomedical Engineering volumen 6, páginas 1225–1235 (2022)Citar este artículo

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Los biosensores portátiles no invasivos para el control continuo de los metabolitos en el sudor pueden detectar algunos analitos en concentraciones suficientemente altas, normalmente durante el ejercicio vigoroso, para generar una cantidad suficiente de biofluido. Aquí presentamos el diseño y el rendimiento de un biosensor electroquímico portátil para el análisis continuo, en el sudor durante el ejercicio físico y en reposo, de niveles de trazas de múltiples metabolitos y nutrientes, incluidos todos los aminoácidos y vitaminas esenciales. El biosensor consiste en electrodos de grafeno que se pueden regenerar repetidamente in situ, funcionalizados con polímeros impresos molecularmente similares a anticuerpos específicos de metabolitos y nanopartículas indicadoras activas redox, e integrados con módulos para inducción de sudor basada en iontoforesis, muestreo de sudor microfluídico, procesamiento de señales y calibración y comunicación inalámbrica. En voluntarios, el biosensor permitió el seguimiento en tiempo real de la ingesta de aminoácidos y sus niveles durante el ejercicio físico, así como la evaluación del riesgo de síndrome metabólico (mediante la correlación de los niveles de aminoácidos en suero y sudor). El monitoreo de metabolitos para la identificación temprana de condiciones de salud anormales podría facilitar aplicaciones en nutrición de precisión.

Los nutrientes circulantes son indicadores esenciales para la salud general y la función corporal1. Los aminoácidos (AA), que provienen de la ingesta dietética y la síntesis de microbiota intestinal, y están influenciados por estilos de vida personales, son biomarcadores importantes para una serie de condiciones de salud (Fig. 1a)2. Los aminoácidos de cadena ramificada elevados (BCAA), que incluyen leucina (Leu), isoleucina (Ile) y valina (Val), están asociados con la obesidad, la resistencia a la insulina y el riesgo futuro de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), enfermedades cardiovasculares (ECV) y cáncer de páncreas3,4,5. Las deficiencias en AA (por ejemplo, arginina y cisteína) podrían obstaculizar el sistema inmunitario al reducir la activación de las células inmunitarias6. El triptófano (Trp), la tirosina (Tyr) y la fenilalanina (Phe) son precursores de los neurotransmisores serotoninérgicos y catecolaminérgicos (dopamina, norepinefrina y epinefrina), respectivamente, y juegan un papel importante en el funcionamiento de los sistemas neuronales complejos y la salud mental7,8. Varias huellas dactilares metabólicas (incluidas Leu, Phe y vitamina D) están relacionadas con la gravedad de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19)9,10. Las disparidades de salud en la nutrición también se correlacionan bien con las alarmantes disparidades raciales y étnicas que empeoran con la vulnerabilidad y la mortalidad por COVID-1911. Además, la disfunción de órganos y tejidos inducida por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 podría resultar en una mayor incidencia de enfermedades cardiometabólicas12.

a, Los nutrientes circulantes como los AA están asociados con varias condiciones fisiológicas y metabólicas. b, Esquema del 'NutriTrek' portátil que permite el control metabólico a través de una fusión sinérgica de LEG, RAR y anticuerpos artificiales. c, d, Esquema (c) y ensamblaje de capas (d) del parche de microfluidos 'NutriTrek' para inducción de sudor, muestreo y biodetección. T, temperatura. e,f, Imágenes de un parche sensor flexible (e) y un sistema portátil con interfaz de piel (f). Barras de escala, 5 mm (e) y 2 cm (f). g, Diagrama de bloques del sistema electrónico de 'NutriTrek'. Los módulos resaltados en guiones rojos están incluidos en la versión de reloj inteligente. CPU, unidad central de procesamiento; POT, potenciometría; In-Amp, amplificador de instrumentación; MCU, microcontrolador; TIA, amplificador de transimpedancia; IP, iontoforesis; CE, contraelectrodo; RE, electrodo de referencia; WE, electrodo de trabajo. h, aplicación móvil personalizada para seguimiento metabólico y nutricional en tiempo real. i, reloj inteligente 'NutriTrek' con un parche sensor desechable y una pantalla electroforética. Barras de escala, 1 cm (arriba) y 5 cm (abajo).

El perfilado y la monitorización metabólicos son un enfoque clave para permitir la nutrición y la medicina de precisión13. Los estándares de oro actuales en evaluación médica y pruebas metabólicas se basan en gran medida en análisis de sangre que son invasivos y episódicos, que a menudo requieren visitas físicas a instalaciones médicas, procesamiento y almacenamiento de muestras que requieren mucha mano de obra e instrumentación delicada (por ejemplo, cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC –MS))14. Dado que la actual pandemia de COVID-19 sigue sin controlarse en todo el mundo, existe una necesidad apremiante de desarrollar sensores portátiles y de telemedicina para monitorear el estado de salud de una persona y permitir una intervención oportuna en entornos domésticos y comunitarios15,16,17,18, 19,20,21,22,23; También es cada vez más importante monitorear el estado de salud nutricional y cardiometabólico a largo plazo de una persona después de la recuperación de una infección grave por COVID-19 usando dispositivos portátiles para detectar signos tempranos de posibles complicaciones endocrinológicas como la DM2.

El sudor es un fluido corporal importante que contiene una gran cantidad de sustancias químicas que reflejan las condiciones nutricionales y metabólicas24,25,26,27. La progresión de los análisis de sangre a los análisis de sudor portátiles podría brindar un gran potencial para el monitoreo continuo no invasivo de biomarcadores fisiológicos críticos para la salud humana28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Sin embargo, los sensores electroquímicos portátiles informados actualmente se centran principalmente en un número limitado de analitos, incluidos electrolitos, glucosa y lactato, debido a la falta de una estrategia adecuada de monitoreo continuo más allá de los electrodos enzimáticos y selectivos de iones o la oxidación directa de moléculas electroactivas25,26,27, 34,35,36,37,38,39,40. Por lo tanto, la mayoría de los nutrientes y metabolitos clínicamente relevantes en el sudor rara vez se exploran y son indetectables por las tecnologías de detección portátiles existentes. Además, los biosensores portátiles actuales generalmente requieren ejercicio vigoroso para acceder al sudor; aunque algunos informes recientes usan iontoforesis basada en gel de pilocarpina para el muestreo de sudor sedentario22,30,36, este enfoque adolece de períodos cortos de sudor y baja precisión de detección debido a la mezcla de sudor y gel fluido y la falta de muestreo dinámico de sudor.

En este artículo, presentamos una estrategia universal de biodetección portátil basada en una combinación juiciosa de grafeno grabado con láser (LEG) producible en masa, nanoinformadores activos redox (RAR) sintetizados electroquímicamente y 'anticuerpos artificiales' basados en polímeros impresos molecularmente (MIP). ', así como tecnologías únicas de calibración y regeneración in situ (Fig. 1b). A diferencia de los sensores de bioafinidad basados en anticuerpos o MIP clásicos, que generalmente son para un solo uso y requieren múltiples pasos de lavado para transducir las interacciones de bioafinidad en soluciones iónicas estándar41,42, este enfoque permite la demostración de sensibilidad, selección y continuidad. monitoreo de una amplia gama de biomarcadores a nivel de trazas en biofluidos, incluidos los nueve AA esenciales, así como vitaminas, metabolitos y lípidos que se encuentran comúnmente en el sudor humano (Tabla complementaria 1). La perfecta integración de este enfoque único con el procesamiento de señales in situ y la comunicación inalámbrica conduce a una potente tecnología portátil de detección de sudor 'NutriTrek' que puede realizar un seguimiento metabólico y nutricional personalizado y no invasivo para una intervención oportuna (Fig. 1b). La incorporación de la inducción de sudor basada en iontoforesis de carbacol y el muestreo eficiente de sudor circundante basado en microfluidos permite un análisis molecular continuo y autónomo prolongado con alta resolución temporal y precisión en todas las actividades, durante el ejercicio físico y en reposo. Usando cinco AA esenciales o condicionalmente esenciales (es decir, Trp, Try y tres BCAA (Leu, Ile y Val)) como nutrientes ejemplares, corroboramos el sistema en varios ensayos en humanos al inscribir tanto a sujetos sanos como a pacientes en el monitoreo personalizado de la fatiga central. , ingestas dietéticas estándar, estado nutricional, riesgos de síndrome metabólico y gravedad de COVID-19.

El parche sensor desechable y flexible consta de dos electrodos de iontoforesis cargados con carbacol, un módulo de microfluidos de entrada múltiple, una matriz de sensores de nutrientes MIP multiplexada, un sensor de temperatura y un sensor de electrolitos (Fig. 1c-f y Fig. 1 complementaria). Todos los diseños de sensores y electrodos flexibles se basan en LEG, que tiene una gran superficie, tiene excelentes propiedades electroquímicas y se puede producir a gran escala directamente sobre un sustrato de poliimida (PI) mediante grabado con láser de CO2 (Figura complementaria 2). El parche sensor puede adherirse fácilmente a la piel con contacto conformado e interfaces con un módulo electrónico miniaturizado para control de iontoforesis bajo demanda, procesamiento de señales in situ y comunicación inalámbrica con las interfaces de usuario a través de Bluetooth (Fig. 1g y Figs. 3 y 4 complementarias). ). Se desarrolló una aplicación móvil personalizada 'NutriTrek' para procesar, mostrar y almacenar la información metabólica dinámica monitoreada por los sensores portátiles (Fig. 1h y Video complementario 1). El sistema portátil también se integró en un reloj inteligente con una pantalla de papel electrónico (Fig. 1i y Fig. 5 complementaria).

La detección universal de AA y otros metabolitos/nutrientes con alta sensibilidad y selectividad se logró mediante un diseño cuidadoso de la capa MIP de unión selectiva en la LEG. Los MIP son receptores sintetizados químicamente formados mediante la polimerización de monómeros funcionales con moléculas molde. Aunque la tecnología MIP se ha propuesto para la detección, la separación y el diagnóstico42,43, aún no se ha demostrado para la detección portátil continua, ya que los sensores MIP clásicos requieren pasos de lavado para la regeneración del sensor y la detección generalmente se realiza en soluciones tampón estándar o redox. En nuestro caso, el monómero funcional (por ejemplo, pirrol) y el reticulante (por ejemplo, APBA) forman inicialmente un complejo con la molécula diana; después de la polimerización, sus grupos funcionales se incrustan en la estructura polimérica de la PIERNA; la extracción posterior de las moléculas objetivo revela sitios de unión en el electrodo LEG-MIP que son complementarios en tamaño, forma y carga al analito objetivo (Fig. 6 complementaria). Se diseñan dos estrategias de detección, directa e indirecta, sobre la base de las propiedades electroquímicas de las moléculas objetivo (Fig. 2). Las optimizaciones y caracterizaciones de los sensores LEG-MIP se detallan en la Nota complementaria 1 y las Figs. complementarias. 7–13.

a, Detección directa de moléculas electroactivas utilizando sensores LEG-MIP. b,c, voltamogramas DPV de los sensores LEG-MIP para la detección directa de Tyr (b) y Trp (c). Inserciones, gráficos de calibración con un ajuste lineal. ∆J, densidad de corriente de altura máxima. d, Detección continua in situ y regeneración de un sensor LEG-MIP Trp en 50 µM Trp. e, Detección molecular indirecta usando sensores LEG-RAR-MIP. f, voltamogramas LSV de detección indirecta de Leu con sensores LEG-PBNP-MIP. Recuadro, gráfico de calibración con un ajuste lineal. g,h, Detección indirecta de todos los AA esenciales (g) y múltiples vitaminas, lípidos y metabolitos (h) usando sensores LEG–PBNP–MIP. Las líneas discontinuas representan líneas de tendencia de ajuste lineal. CV, vitamina C; VB6, vitamina B6; VD3, vitamina D3; VE, vitamina E. i, Esquema de sensores multi-MIP AA. j, voltamogramas LSV de un sensor multi-MIP LEG para la cuantificación de BCAA. Recuadro, gráfico de calibración con un ajuste lineal. k, Detección continua in situ y regeneración de un sensor LEG–PBNP–MIP Leu en 50 µM Leu. l, Exploraciones CV repetitivas de un electrodo LEG-PBNP en KCl 0,1 M. m, Voltamogramas DPV de detección Leu indirecta con sensores LEG–AQCA–MIP. Recuadro, la gráfica de calibración. n, Regeneración in situ de un sensor LEG–AQCA–MIP Leu en una muestra de sudor sin tratar. o, Selectividad de los sensores Trp, Tyr, Leu, Ile, Val y BCAA frente a otros AA. p, Validación de sensores Tyr, Trp y Leu para analizar muestras de sudor de ejercicio sin procesar (n = 20) contra GC-MS. Todas las barras de error representan la desviación estándar (sd) de tres sensores.

Para las moléculas electroactivas en el sudor, la oxidación de las moléculas objetivo unidas en la plantilla MIP se puede medir directamente mediante voltametría de pulso diferencial (DPV) en la que la altura de la corriente máxima se correlaciona con la concentración del analito (Fig. 2a). Teniendo en cuenta que múltiples moléculas electroactivas se pueden oxidar a potenciales similares, este enfoque LEG-MIP aborda los problemas de sensibilidad y selectividad. Por ejemplo, Tyr y Trp, dos AA con potenciales redox cercanos (~ 0.7 V), podrían detectarse selectivamente con esta estrategia (Fig. 2b, c y Fig. 14 complementaria). Se observaron relaciones lineales entre las densidades de corriente de altura máxima y las concentraciones objetivo con sensibilidades de 0,63 µA µM−1 cm−2 y 0,71 µA µM−1 cm−2 respectivamente para los sensores LEG–MIP Tyr y Trp (Figura complementaria 15). Vale la pena señalar que las elecciones de proporciones de monómero/entrecruzador/plantilla y los períodos de incubación tienen influencias sustanciales en la respuesta del sensor, mientras que el volumen de la muestra no lo hace (Fig. 10 complementaria). Los sensores Tyr y Trp se pueden regenerar in situ de manera fácil y repetible sin ningún paso de lavado con una corriente-tiempo (IT) de amperometría de alto voltaje que oxida los objetivos unidos en sus potenciales redox (Fig. 2d).

Como la mayoría de los metabolitos y nutrientes (por ejemplo, los BCAA) no son electroactivos y no se pueden oxidar fácilmente en condiciones operativas, aquí utilizamos un enfoque de detección indirecta que involucra una capa RAR intercalada entre las capas LEG y MIP para permitir una cuantificación rápida (Fig. 2e). La adsorción selectiva de las moléculas diana sobre la capa polimérica impresa disminuye la exposición del RAR a la matriz de la muestra. Se pueden aplicar técnicas voltamétricas de potencial controlado como DPV o voltametría de barrido lineal (LSV) para medir el pico de oxidación o reducción de RAR, donde la disminución en la densidad de corriente de la altura del pico corresponde a un aumento en los niveles de analito. Por ejemplo, usando nanopartículas de azul de Prusia (PBNP) como RAR (Fig. 11 complementaria), desarrollamos un sensor MIP-LEG Leu con una relación logarítmica lineal entre la disminución de la altura máxima y la concentración de Leu y una sensibilidad de 702 nA mm− 2 por década de concentración (Fig. 2f). Establecimos este enfoque para cuantificar el rango fisiológicamente relevante de los nueve AA esenciales (es decir, Leu, Ile, Val, Trp, Phe, histidina (His), lisina (Lys), metionina (Met) y treonina (Thr)) ( Fig. 2g y Fig. 16 complementaria), así como una serie de vitaminas, metabolitos y lípidos (vitaminas B6, C, D3 y E, glucosa, ácido úrico, creatina, creatinina y colesterol) (Fig. 2h y Fig. 17 complementaria ). Además de estos nutrientes y metabolitos, este enfoque se puede reconfigurar fácilmente para permitir el seguimiento de un amplio espectro de biomarcadores que van desde hormonas (por ejemplo, cortisol) hasta fármacos (por ejemplo, el fármaco inmunosupresor ácido micofenólico) (Figura complementaria 18 y Cuadros complementarios 2 y 3). La mayoría de estos objetivos son indetectables continuamente por cualquier tecnología portátil existente. Teniendo en cuenta que un nivel total de múltiples nutrientes (por ejemplo, BCAA totales) suele ser un indicador de salud importante, se puede usar un enfoque MIP de múltiples plantillas para permitir la detección precisa y sensible de la concentración total de múltiples objetivos con un solo sensor (Fig. .2i,j). Estos sensores LEG-RAR-MIP indirectos se pueden regenerar in situ aplicando un potencial constante al electrodo de trabajo, que repele las moléculas objetivo unidas de la capa MIP, logrando una reutilización prolongada (Fig. 2k).

Los sensores LEG-MIP muestran respuestas estables durante el uso repetible: el RAR basado en PBNP mostró señales redox estables a lo largo de 60 escaneos repetitivos de voltamperometría cíclica (CV) (Fig. 2l y Fig. 11 complementaria); se observaron cambios mínimos en la producción durante un período de almacenamiento de 42 días (Figura complementaria 19a, b); los sensores tampoco mostraron un cambio de señal relativo sustancial cuando se usaron continuamente durante 5 días (Fig. 19c complementaria). En comparación con los procesos tradicionales de preparación de MIP, la capa de MIP electrodepositada en la LEG producible en masa conduce a una alta reproducibilidad en selectividad, sensibilidad y consistencia de dispositivo a dispositivo (Figuras complementarias 20 y 21). La elección de LEG como sustrato de deposición MIP también mostró ventajas en la sensibilidad del sensor en comparación con los electrodos clásicos como el electrodo de carbón vítreo, el electrodo de carbón impreso y el electrodo de Au (Fig. 22 complementaria). Otros RAR, como el ácido antraquinona-2-carboxílico (AQCA), también se pueden usar para la detección indirecta de AA con un rendimiento estable (aquí se usó DPV escaneado negativamente para monitorear la reducción de AQCA) (Fig. 2m y Fig. 23 complementaria). Como se ilustra en la Fig. 2n, los sensores LEG–AQCA–MIP podrían regenerarse directamente en una muestra de sudor humano sin procesar, resolviendo un cuello de botella principal de la biodetección portátil. Los sensores MIP-LEG AA tienen una excelente selectividad para otros analitos en el sudor (incluidos los AA con estructuras similares) en concentraciones fisiológicamente relevantes (Fig. 2o, Fig. 24 complementaria y Tabla complementaria 3). La tecnología LEG-MIP mostró una sensibilidad comparable con la actual GC-MS44 basada en laboratorio estándar de oro (Fig. 25 complementaria); las mediciones del sensor en muestras de sudor humano sin procesar se validaron contra GC-MS (Fig. 2p y Figs. 26 y 27 complementarias).

Para permitir el monitoreo metabólico y nutricional continuo en el cuerpo, el parche del sensor flexible se diseñó para comprender un módulo de iontoforesis para la inducción de sudor localizada bajo demanda, un módulo de microfluidos de entrada múltiple para un muestreo de sudor eficiente, una matriz de sensores de nutrientes de sudor LEG-MIP multiplex para el análisis continuo de AA, y sensores de temperatura y electrolitos basados en LEG para la calibración del sensor de AA en tiempo real (Fig. 3a). A diferencia de la detección clásica del sensor de bioafinidad en soluciones tampón o redox, el análisis del sudor in situ plantea más desafíos debido a la composición compleja y variada del sudor y exige innovaciones tecnológicas para una detección corporal precisa. Por ejemplo, para la detección directa de PIERNA-MIP Trp, una exploración DPV en el sudor incluso antes del reconocimiento del objetivo/MIP podría conducir a un pico de oxidación ya que una pequeña cantidad de moléculas electroactivas (por ejemplo, Trp y Tyr) pueden oxidarse en la superficie de capa MIP; después del reconocimiento y unión de Trp en las cavidades de MIP, se puede obtener una altura de pico de corriente sustancialmente mayor; la diferencia de medición de las alturas de los dos picos permite una medición más precisa del Trp unido directamente en el sudor con alta selectividad (Fig. 3b-d). La influencia de la temperatura y la fuerza iónica en los sensores AA se puede calibrar en tiempo real sobre la base de las lecturas de un sensor de temperatura resistente a la deformación basado en LEG y un sensor de Na+ selectivo de iones (Fig. 3e y Fig. 28 complementaria) . Teniendo en cuenta que se informó que la tasa de sudoración durante el ejercicio influye en ciertos niveles de biomarcadores, podríamos usar el nivel de Na+ en el sudor (que mostró una correlación lineal con la tasa de sudoración) para calibrar aún más los niveles de nutrientes para un análisis personalizado. Esta estrategia de transducción única que involucra tanto las exploraciones DPV de dos pasos como las calibraciones de temperatura/electrolito nos permite obtener lecturas precisas de manera continua en el sudor durante el uso en el cuerpo (Figura complementaria 29).

a, Ilustración de un parche de sensor portátil multifuncional. ISE, electrodo selectivo de iones. b–d, la estrategia de calibración del sensor de dos escaneos que permite la detección selectiva de Trp in situ en presencia de Tyr. ∆I, corriente de altura máxima; ∆I′, diferencia de altura máxima provocada por el reconocimiento del objetivo. Las curvas sólidas y discontinuas en c y d representan líneas de tendencia de ajuste lineal. e, Calibración de electrolitos de la lectura del sensor AA, con un ajuste lineal. f, Esquema de muestreo de sudor localizado basado en extracción iontoforética de sudor con agentes muscarínicos: pilocarpina y carbacol. g,h, tasas de sudoración localizadas medidas en las áreas de la piel estimuladas (g) y circundantes (h) después de una iontoforesis de 5 min con pilocarpina y carbacol. Las curvas continuas y discontinuas representan líneas de tendencia de ajuste cuadrático. S, sujeto. i, Distribuciones de concentración de Trp simuladas numéricamente ([Trp]) en el reservorio de microfluidos a los 120 s después de que el fluido de entrada cambió de 20 a 80 µM Trp (tasa de flujo de 1,5 µl min−1) (con diseños variados en número de entrada, amplitud de ángulo, y orientación de entrada y salida). j, Evaluación en el cuerpo del parche microfluídico flexible optimizado para una inducción de sudor iontoforético basada en carbacol eficiente y muestreo circundante en reposo. Las marcas de tiempo representan el período (min) después de una sesión de iontoforesis de 5 minutos. Se usó tinte negro en el depósito para facilitar la visualización directa del flujo de sudor en los microfluidos. Barra de escala, 3 mm.

Para hacer que esta tecnología portátil sea ampliamente aplicable, en particular para las personas sedentarias, aquí utilizamos un módulo de iontoforesis diseñado a medida que consiste en el ánodo y el cátodo LEG junto con hidrogeles que contienen el agente muscarínico carbacol (carbagel) para la extracción sostenible del sudor. El carbachol se seleccionó entre varios agentes muscarínicos, ya que permite la secreción de sudor más eficiente, repetible y duradera de la glándula sudorípara circundante debido a sus efectos nicotínicos adicionales45 (Fig. 3f-h, Fig. 30 complementaria y Nota complementaria 2). Por el contrario, el agente inductor de sudor clásico, la pilocarpina, utilizado por la prueba de sudor estándar y los sistemas portátiles informados anteriormente22,30,36 ofrece solo un período corto de sudor y una tasa de sudoración muy limitada de las glándulas sudoríparas vecinas (Fig. 3f-h ). Además, el muestreo de la mezcla del sudor filtrado debajo del gel de pilocarpina y el fluido del gel podría generar errores sustanciales en el sensor portátil y no proporcionar información en tiempo real debido a la ausencia de una renovación eficaz del sudor. Se utiliza una corriente muy pequeña (50–100 µA) para nuestro módulo de iontoforesis, en comparación con 1–1,5 mA comúnmente utilizado (refs. 22, 30, 36), lo que reduce en gran medida el riesgo de irritación de la piel. Para maximizar la eficiencia del muestreo de sudor de bajo volumen y mejorar la resolución temporal de la detección portátil, se diseñó cuidadosamente un módulo de microfluidos compacto y flexible para aislar las áreas de muestreo de sudor de los geles de iontoforesis. Se realizaron simulaciones numéricas para optimizar el diseño geométrico del módulo de microfluidos, incluido el número de entrada, la amplitud del ángulo, la orientación y la dirección del flujo con respecto a la geometría del reservorio (Fig. 3i, Nota complementaria 3, Figuras complementarias 31 y 32, Video complementario 2 y Tabla Suplementaria 4). Con el diseño optimizado para la inducción y el muestreo de sudor, el sudor se puede inducir convenientemente de forma local y muestrear fácilmente con microfluidos de entrada múltiple durante un período prolongado (Fig. 3g, j, Fig. 33 complementaria y Video complementario 3). A tasas de sudoración fisiológica que oscilan entre 0,15 µl min−1 y 3 µl min−1, nuestro parche sensor portátil podría proporcionar un análisis fiable y preciso de los cambios dinámicos de los niveles de AA (Figuras complementarias 34 y 35).

La evaluación del sistema portátil se realizó primero a través de la detección de Trp y Tyr del sudor en sujetos humanos durante una prueba de ejercicio de ciclismo de carga constante (Fig. 4a-d y Fig. 36 complementaria). Los datos DPV de los sensores se transmitieron de forma inalámbrica junto con las lecturas del sensor de temperatura y Na+ a la aplicación móvil que extrajo automáticamente los picos de oxidación mediante un algoritmo de corrección de línea de base iterativo desarrollado a medida (Fig. 4e y Fig. 37 complementaria) y realizó la calibración para el cuantificación precisa de sudor Tyr y Trp. Teniendo en cuenta que los AA (por ejemplo, Try y BCAA) desempeñan un papel crucial en la fatiga central durante el ejercicio físico46, se utilizó un conjunto de sensores Trp y BCAA flexibles para monitorear la dinámica de AA durante el ejercicio vigoroso (Fig. 4f-j y Fig. 38 complementaria). ). Los niveles de Trp y BCAA disminuyeron durante el ejercicio debido a la síntesis de serotonina y la ingesta de BCAA, respectivamente. Se observó un aumento en la proporción de Trp a BCAA en sudor, lo que podría servir potencialmente como un indicador de fatiga central, de acuerdo con un informe anterior sobre su contraparte en plasma46.

a-d, análisis continuo de Trp y Tyr en el cuerpo utilizando una matriz de sensores portátiles con calibraciones de sensores en tiempo real durante el ejercicio de ciclismo. e, Análisis de voltamograma personalizado con una estrategia de extracción automática de picos basada en un procedimiento de corte y ajuste polinomial. f–j, Análisis dinámico de Trp en sudor y BCAA durante el ejercicio físico para el control de la fatiga central. Las líneas discontinuas en h–j representan líneas de tendencia de ajuste cuadrático. k–o, Análisis dinámico de los niveles de AA en el sudor con y sin ingesta de suplementos de Trp y Tyr en reposo para un seguimiento nutricional personalizado.

Datos fuente

El parche integrado de iontoforesis portátil permite la monitorización diaria continua de AA en reposo más allá del ejercicio físico. Como se ilustra en la Fig. 4k–o y las Figs. complementarias. 39–42, se observaron niveles crecientes de Trp y Tyr en el sudor de los cuatro sujetos después de la ingesta de suplementos de Trp y Tyr, mientras que las lecturas de los sensores permanecieron estables durante los estudios sin ingesta. Tal capacidad abre la puerta para el control y la gestión nutricional personalizados a través de una intervención dietética personalizada guiada por sensores. Cabe señalar que nuestro estudio piloto mostró que los niveles de nutrientes y electrolitos en el sudor eran independientes de los cambios en la tasa de sudor durante el sudor inducido por iontoforesis basada en carbacol (Figura complementaria 43).

El síndrome metabólico, caracterizado por obesidad abdominal y resistencia a la insulina, se está convirtiendo en la principal causa de morbilidad y mortalidad y afecta a más de un tercio de todos los adultos en los Estados Unidos47. Los niveles elevados de BCAA circulantes predicen la obesidad resistente a la insulina y el síndrome metabólico, y están relacionados con las ECV y la DM2 (Fig. 5a y Nota complementaria 4)3,4, lo que podría conducir a posibles complicaciones de la COVID-19 grave (ref. 12). ). Estudios recientes han demostrado el uso potencial de la suplementación con BCAA como una intervención dietética para mejorar la resistencia a la insulina48. El seguimiento de los cambios en los niveles de nutrientes esenciales proporciona una detección temprana muy sensible de los riesgos del síndrome metabólico, lo que permite una intervención dietética personalizada eficaz (Fig. 5b). Para explorar el uso de los BCAA del sudor como factor de riesgo no invasivo del síndrome metabólico, realizamos un estudio piloto para investigar las correlaciones entre los BCAA del suero y del sudor en tres grupos de sujetos: peso normal (I, n = 10), sobrepeso/ obesidad (II, n = 7) y obesidad con DM2 (III, n = 3) (Fig. 5c, d). Se observaron coeficientes de correlación de Pearson positivos de 0,66 (n = 65) y 0,69 (n = 65) entre los niveles de suero y sudor (todos analizados por los sensores) de Leu y BCAA totales, respectivamente (Fig. 5c). En comparación con los participantes sanos en el grupo I, se observaron niveles sustancialmente elevados de Leu en suero y sudor (analizados por los sensores) en los grupos II y III (Fig. 5d), de acuerdo con informes anteriores de que se identificaron niveles de BCAA circulantes más altos en personas con obesidad y T2DM3. Teniendo en cuenta el papel bien establecido de los BCAA en la producción de insulina y la inhibición de la glucogenólisis, también investigamos la respuesta posprandial del sudor Leu/BCAA y la glucosa en sangre/insulina después del suplemento de BCAA y la ingesta dietética en sujetos sanos (Fig. 5e, f) . Todos los biomarcadores permanecieron estables durante el período de ayuno; La ingesta de proteínas en la dieta resultó en aumentos tanto de la glucosa como de la insulina en la sangre, mientras que la ingesta de BCAA solo condujo a un rápido aumento de la insulina. En ambos estudios, el Leu del sudor y los BCAA aumentaron primero en los 30 a 60 minutos y luego disminuyeron. Para sujetos con diferentes condiciones metabólicas, los niveles de Leu en el sudor iontoforético después de BCAA varían de manera diferente: aunque se observó un aumento sustancial en los niveles de Leu en el sudor en todos los casos, los sujetos sanos mostraron una fluctuación porcentual drástica y los individuos con obesidad/DM2 mostraron una fluctuación brusca que puede indicar la diferente etapa metabólica de BCAA en esos individuos (Fig. 5g).

a, Niveles elevados de BCAA identificados en personas con obesidad y/o DM2. b, Las estrechas asociaciones entre el metabolismo de los BCAA y la respuesta de la insulina en grupos sanos y con obesidad/T2DM. c, Correlación de los niveles totales de BCAA y Leu en suero y sudor obtenidos con los sensores LEG-MIP (n = 65). Las líneas discontinuas representan líneas de tendencia de ajuste lineal. d, Diagrama de caja y bigotes de los niveles de Leu medidos en sudor y suero extraídos por iontoforesis en tres grupos de participantes: peso normal (grupo I, n = 10), sobrepeso u obesidad (grupo II, n = 7) y obesidad con T2DM (grupo III, n = 3), el bigote inferior representa el mínimo, el bigote superior representa el máximo y el cuadrado en el cuadro representa la media. e,f, Cambios dinámicos de los niveles de Leu en sudor y BCAA totales, insulina sérica (Ins) y glucosa en sangre (BG) de dos sujetos sanos con ingestas de 5 g de BCAA (e) y una dieta estándar de proteínas (f). g, dinámica de Sweat Leu recopilada de los grupos I-III después de la ingesta de 5 g de BCAA. Recuadro, proporción del nivel de Leu a los 50 min después de la ingesta de BCAA y el nivel antes de la ingesta. h, Evaluación de Leu como huella digital metabólica para la gravedad de COVID-19 en muestras de suero de sujetos negativos para COVID-19 (n = 8) y pacientes positivos para COVID-19 (n = 8). Las barras de error representan la sd de tres mediciones.

Datos fuente

Teniendo en cuenta que se ha informado que el nivel elevado de Leu circulante es una huella digital metabólica clave para la gravedad de la COVID-19, también evaluamos nuestros biosensores para analizar las muestras de pacientes con COVID-19 e individuos sanos; Se identificaron niveles de Leu sustancialmente elevados en muestras positivas para COVID-19 en comparación con las negativas (415,6 ± 133,7 versus 151,5 ± 36,0 µM), lo que indica el gran potencial de nuestros biosensores para el control y manejo de COVID-19 en el hogar (Fig. 5h ).

Los biomarcadores metabólicos circulantes, como los AA y las vitaminas, se han asociado con diversas afecciones de salud, incluidas la diabetes y las enfermedades cardiovasculares. La elaboración de perfiles metabólicos con sensores portátiles se ha vuelto cada vez más crucial en la nutrición y la medicina de precisión, especialmente en la era de la pandemia de COVID-19, ya que proporciona no solo información sobre la gravedad de COVID-19, sino también orientación para mantenerse metabólicamente saludable y minimizar el riesgo de posible infección por COVID-19. Dado que la pandemia continúa rampante en todo el mundo y los servicios médicos regulares corren el riesgo de escasez, existe una necesidad urgente de desarrollar y aplicar sensores portátiles que puedan monitorear las condiciones de salud a través de perfiles metabólicos para lograr un diagnóstico en el hogar y una intervención oportuna a través de la telemedicina. Sin embargo, los sensores electroquímicos portátiles actuales están limitados a una gama estrecha de objetivos de detección debido a la falta de estrategias de detección continua más allá de los electrodos enzimáticos y selectivos de iones. Aunque se han desarrollado varios sensores basados en bioafinidad para detectar un espectro más amplio de objetivos mediante anticuerpos o MIP, generalmente requieren varios pasos de lavado o solo se usan una vez; estas limitaciones han obstaculizado su usabilidad en dispositivos portátiles. Además, la mayoría de los biosensores portátiles dependen del ejercicio vigoroso para acceder al sudor y no son adecuados para el uso continuo diario.

Al integrar LEG producible en masa, RAR sintetizados electroquímicamente y 'anticuerpos artificiales', hemos demostrado una poderosa estrategia de biodetección portátil universal que puede lograr la detección selectiva de una amplia gama de biomarcadores (incluidos todos los AA esenciales, vitaminas, metabolitos, lípidos, hormonas y fármacos) y una regeneración in situ fiable. Además, para permitir el monitoreo metabólico y nutricional continuo y bajo demanda en todas las actividades, hemos integrado el conjunto de sensores LEG-MIP y la inducción de sudor basada en iontoforesis en una tecnología portátil inalámbrica, con muestreo de sudor reflejo sudomotor axónico microfluídico de entrada múltiple optimizado, procesamiento de señales in situ, calibración y comunicación inalámbrica. Usando esta tecnología de telemedicina, hemos demostrado el monitoreo portátil y continuo de las respuestas AA posprandiales para identificar los riesgos del síndrome metabólico. La alta correlación entre los BCAA del sudor y del suero sugiere que esta tecnología es muy prometedora para su uso en el control del riesgo de síndrome metabólico. La diferencia sustancial en Leu entre las muestras de sangre positivas para COVID-19 y negativas para COVID-19 indica el potencial de usar esta tecnología para el manejo de COVID-19 en el hogar. Prevemos que esta tecnología portátil podría desempeñar un papel crucial en la realización de una nutrición de precisión a través del control continuo de los biomarcadores circulantes y permitir una intervención nutricional personalizada. Esta tecnología también podría reconfigurarse para monitorear continuamente una variedad de otros biomarcadores hacia una amplia gama de aplicaciones preventivas, diagnósticas y terapéuticas personalizadas.

El ácido úrico, la l-tirosina, el nitrato de plata, el cloruro de hierro (III), el clorhidrato de dopamina, el cloruro de colina, la creatinina, la sal de calcio del ácido pantoténico, la citrulina, la piridoxina y el ácido láctico se adquirieron de Alfa Aesar. Tiosulfato de sodio pentahidratado, bisulfito de sodio, triptófano, leucina, alanina, isoleucina, metionina, valina, lisina, clorhidrato de tiamina, serina, ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, AQCA, ácido 3-aminofenilborónico (APBA), anilina, o-fenilendiamina, azul de metileno , tionina, hidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), etanolamina, N-(3-dimetil-aminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDC), sal sódica de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS), suero bovino la albúmina (BSA), el clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl), el conjugado de estreptavidina-peroxidasa (Roche) y la hidroquinona se adquirieron de Sigma-Aldrich. Se obtuvieron perlas magnéticas modificadas con ácido carboxílico (MB; Dynabeads, M-270) de Invitrogen. El ferricianuro de potasio y el ferrocianuro de potasio se adquirieron de Acros Organics. Ácido acético, metanol, acetato de sodio, cloruro de sodio, dihidrogenofosfato de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato de potasio, urea, ácido l-ascórbico y dextrosa (d-glucosa) anhidra, glicina, arginina, inositol, ornitina, ácido aspártico, treonina, histidina, riboflavina, creatina, fenilalanina, ácido nicotínico, ácido fólico, ácido glutámico y peróxido de hidrógeno (30 % (p/v)) se adquirieron de Thermo Fisher Scientific. El anticuerpo de captura de insulina y el anticuerpo detector biotinilado se adquirieron de R&D Systems (Human/Canine/Porcine Insulin DuoSet ELISA). Los electrodos de carbono serigrafiados y el soporte magnético se adquirieron de Metrohm DropSens. Los adhesivos médicos se adquirieron de 3 M y Adhesives Research. Las películas de PI (75 μm de espesor) se adquirieron de DuPont. Las películas de PET (12 μm de espesor) se adquirieron de McMaster-Carr.

Los electrodos LEG se fabricaron sobre una película de PI con un espesor de 75 μm (DuPont) con un cortador láser de CO2 de 50 W (Universal Laser System). Al grabar el PI con un cortador láser de CO2, la energía del láser absorbida se convierte en calor local y, por lo tanto, conduce a una temperatura localizada alta (>2500 °C), se rompen los enlaces químicos en la red de PI y se produce una reorganización térmica del carbono. átomos se produce, lo que resulta en láminas de estructuras de grafeno. Los parámetros optimizados para los electrodos de grafeno y las conexiones electrónicas fueron potencia del 8 %, velocidad del 15 % y puntos por pulgada (PPI) de 1000 en modo de trama con exploración de tres veces. Para el área de detección activa del sensor de temperatura, los parámetros optimizados fueron 3 % de potencia, 18 % de velocidad y 1000 PPI en modo vectorial con escaneo único. Para preparar el electrodo de referencia, primero se modificó Ag en el electrodo de grafeno correspondiente mediante electrodeposición multicorriente con una estación de trabajo electroquímica (CHI 832D) a −0,01 mA durante 150 s, −0,02 mA durante 50 s, −0,05 mA durante 50 s, − 0,08 mA durante 50 s y -0,1 mA durante 350 s usando una solución de recubrimiento que contiene nitrato de plata 0,25 M, tiosulfato de sodio 0,75 M y bisulfito de sodio 0,5 M. Para obtener el electrodo de Ag/AgCl, se dejó caer una solución de FeCl3 0,1 M sobre la superficie de Ag durante 30 s y luego se preparó un cóctel de referencia de 3 µl de polivinil butiral (PVB) disolviendo 79,1 mg de PVB y 50 mg de NaCl en 1 ml de Se dejó caer metanol sobre el electrodo de Ag/AgCl y se secó durante la noche. El electrodo selectivo de Na+ se preparó de la siguiente manera: 0,6 µl de mezcla de membrana selectiva de Na+ preparada disolviendo 1 mg de ionóforo X de Na, 0,55 mg de tetrakis[3,5-bis(trifluorometil)fenil]borato de sodio, 33 mg de cloruro de polivinilo y Se vertieron gota a gota 65,45 mg de sebacato de bis(2-etilhexilo) en 660 µl de tetrahidrofurano sobre el electrodo de grafeno y se secaron durante la noche. Para obtener el rendimiento de detección de Na+ estable deseado para mediciones continuas a largo plazo, el sensor de Na+ obtenido se acondicionó durante la noche en NaCl 100 mM.

El proceso de fabricación de la matriz de sensores LEG-MIP se ilustra en la figura complementaria 6. Todas las capas de MIP se sintetizan mediante electropolimerización. La solución de polimerización se preparó disolviendo plantilla 5 mM (por ejemplo, AA diana), APBA 12,5 mM y pirrol 37,5 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M (pH 6,5). Para el sensor BCAA multi-MIP, se usaron 5 mM de cada objetivo (es decir, Leu, Ile y Val). Antes de la deposición de MIP, la LEG se activó en H2SO4 0,5 M con escaneos CV para 60 segmentos (−1,2 a 1 V con una velocidad de escaneo de 500 mV s−1). Para los sensores LEG-MIP de detección directa, el polímero impreso objetivo se sintetizó electroquímicamente en el electrodo LEG con deposición CV (0–1 V durante diez ciclos, 50 mV s−1) usando la solución de polimerización preparada. Las moléculas diana se extrajeron sumergiendo el electrodo en una mezcla de ácido acético/metanol (7:3 v/v) durante 1 h. Posteriormente, el electrodo resultante se sumergió en PBS 0,01 M (pH 6,5) para exploraciones de CV repetitivas (0,4–1 V con una velocidad de exploración de 50 mV s−1) hasta que se obtuvo una respuesta estable. Para el polímero LEG no impreso, el electrodo se preparó siguiendo el mismo procedimiento que el LEG-MIP, excepto que no se agregó plantilla en la solución de polimerización.

Para los sensores MIP de detección indirecta, los RAR sintetizados electroquímicamente (por ejemplo, PBNP o AQCA) se modificaron primero en el electrodo LEG. El RAR de PBNP en la PIERNA se preparó con CV (20 ciclos) (-0,2 a 0,6 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1) en una solución acuosa que contenía 3 mM FeCl3, 3 mM K3Fe(CN)6, 0,1 M HCl y KCl 0,1 M. Se necesita una capa de PBNP con una señal redox apropiada para producir una buena sensibilidad para los sensores MIP finales; Para lograr esta señal redox adecuada y estable, el electrodo LEG se enjuagó con agua destilada después de la deposición inicial de azul de Prusia (PB), y el paso de electrodeposición de PB se repitió dos veces más hasta obtener un pico de LSV estable de 70 µA en una solución de KCl 0,1 M. logrado. Posteriormente, el LEG-PB se enjuagó con agua destilada y se sumergió en una solución que contenía HCl 0,1 M y KCl 0,1 M para exploraciones CV repetitivas (-0,2 a 0,6 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1) hasta que se obtuvo una respuesta estable. obtenido. Para preparar el RAR de AQCA en la PIERNA, primero se incubó el electrodo de la PIERNA en 50 µl de PBS (pH 6,5) con AQCA 5 mM a 4 °C durante la noche. Posteriormente, el LEG-AQCA se enjuagó con agua destilada y se sumergió en una solución tampón de fosfato para exploraciones CV repetitivas (-0,8 a 0 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1) hasta que se obtuvo una respuesta estable. Para los sensores LEG–PB–MIP de detección indirecta, se llevó a cabo un proceso adicional de activación de PB justo después de la extracción de la plantilla (escaneo de TI a 1 V en HCl 0,5 M durante 600 s), seguido de un proceso de estabilización del sensor LEG–PB–MIP en KCl 0,1 M (exploraciones CV de -0,2 a 0,6 V con una velocidad de exploración de 50 mV s-1). Cabe señalar que, para el sensor LEG–AQCA–MIP, solo se usaron tres ciclos CV de polimerización para preparar la capa MIP, y el sensor se estabilizó en PBS 0,01 M (pH 6,5) (barridos CV a -0,8 a 0 V con una velocidad de exploración de 50 mV s−1).

La morfología de los materiales se caracterizó mediante microscopía electrónica de barrido (Nova Nano SEM 450) y microscopía electrónica de transmisión (Talos S-FEG FEI, EE. UU.). El espectro Raman de los electrodos con diferente modificación se registró utilizando un láser de 532,8 nm con un inVia Reflex (Renishaw). Los espectros infrarrojos por transformada de Fourier se midieron usando espectrometría infrarroja (Nicolet 6700).

Se caracterizó un conjunto de sensores electroquímicos en soluciones de analitos objetivo. Todas las caracterizaciones de sensores in vitro se realizaron a través de CHI 832D. La respuesta del sensor de Na+ se caracterizó con mediciones de potencial de circuito abierto en las soluciones que contenían niveles variados de Na+. Se realizó un análisis de DPV para todas las caracterizaciones del sensor LEG-MIP de detección directa en PBS 0,01 M (pH 6,5) o en sudor puro. Las condiciones de DPV fueron las siguientes: rango, 0,4–1 V; potencial incremental, 0,01 V; amplitud de pulso, 0,05 V; ancho de pulso, 0,05 s; período de pulso, 0,5 s; y sensibilidad, 1 × 10−5 AV−1. Para la detección indirecta in vitro de las moléculas diana basadas en los sensores LEG–PB–MIP, se realizó un análisis de LSV (0,4–0 V) en KCl 0,1 M. Las condiciones de LSV fueron las siguientes: rango, 0,4–0 V; velocidad de exploración, 0,005 V s−1; intervalo de muestra, 0,001 V; tiempo de silencio, 2 s; y sensibilidad, 1 × 10−4 AV−1. Para la detección indirecta in vitro de las moléculas diana basadas en los sensores LEG–AQCA–MIP, se realizó un análisis DPV negativo (0 a −0,8 V) en PBS 0,01 M. Las condiciones de DPV negativas fueron las siguientes: 0 a -0,8 V; potencial incremental, 0,01 V; amplitud de pulso, 0,05 V; ancho de pulso, 0,05 s; período de pulso, 0,5 s; y sensibilidad, 1 × 10−5 AV−1. Para la medición in situ del analito en sudor, se registraron las curvas de señal y de fondo antes y después de la incubación; la corriente de señal se obtuvo como la diferencia de las amplitudes máximas entre la señal posterior a la incubación y las curvas de corriente de fondo (Fig. 3b-d y Fig. 29 complementaria). La caracterización del sensor de temperatura se llevó a cabo en una placa calefactora de cerámica (Thermo Fisher Scientific) (Fig. 28 complementaria). La respuesta del sensor se registró utilizando un analizador de parámetros (Keithley 4200A-SCS) y se comparó con las lecturas de un termómetro infrarrojo (LASERGRIP 800; Etekcity).

Para evaluar el rendimiento de los diversos sustratos de electrodos para la detección de AA basada en MIP, se eligieron LEG, electrodo de carbón impreso, electrodo de Au y electrodo de carbón vítreo. Los electrodos de carbón vítreo se adquirieron de CH Instruments. Los electrodos de carbono impresos se imprimieron en el sustrato PI utilizando una impresora de materiales Dimatix DMP-2850 (Fujifilm, Minato, Japón) con una tinta de carbono comercial de NovaCentrix. Los electrodos de Au se fabricaron mediante evaporación por haz de electrones: se depositaron 20 nm de Cr y 100 nm de Au sobre un sustrato de PET pretratado con plasma de O2. Las películas MIP se prepararon con deposición CV (0–1 V durante diez ciclos, 50 mV s−1).

El módulo de microfluidos se fabricó con un cortador láser de CO2 de 50 W (Universal Laser System) (Fig. 1 complementaria). Brevemente, se diseñaron capas de adhesivos médicos de doble cara y de una cara (3M) con canales, entradas, contornos de gel de iontoforesis y depósitos. Para todas las capas de microfluidos, los contornos del gel de iontoforesis se modelaron para permitir el flujo de corriente desde la capa superior del electrodo PI. La capa inferior, que es la capa adhesiva de doble cara en contacto con la piel (capa de acumulación), se modeló con un pozo de acumulación de sudor (3M 468MP, parámetros láser: potencia 60 %, velocidad 90 %, PPI 1000). La segunda capa (la capa de entrada), en contacto con la capa de acumulación, se modeló con múltiples entradas (PET de 12 μm de espesor, parámetros láser: potencia 20 %, velocidad 100 %, PPI 1000). La tercera capa (capa de canal), en contacto con la capa de entrada, se modeló con canales microfluídicos (Adhesivos Research 93049, parámetros láser: potencia 45 %, velocidad 100 %, PPI 1000). La cuarta capa (capa del depósito), intercalada entre la capa del canal y la capa del electrodo PI, se modeló con el depósito y la salida (3M 468MP, parámetros láser: potencia 60 %, velocidad 90 %, PPI 1000). El depósito es una elipse con un eje mayor de 5,442 mm y un eje menor de 4,253 mm para encerrar completamente el área de detección activa. El grosor de la capa del canal es de ~0,1 mm (Adhesivos Research 93049) y el grosor de la capa del depósito es de 0,13 mm (3M 468MP). El área del depósito es de 18,17 mm2 y, por lo tanto, el volumen del depósito puede calcularse como el área multiplicada por el espesor de la capa del depósito (0,13 mm), que da un total de 2,36 µl.

Los hidrogeles que contenían agente muscarínico carbacol se prepararon como sigue. Brevemente, para el gel de ánodo, se añadió agarosa (3 % p/p) en agua desionizada y luego se calentó a 250 °C con agitación constante. Después de que la mezcla hirviera por completo y se volviera homogénea sin granos de agarosa, la mezcla se enfrió a 165 °C y se añadió carbacol al 1 % a la mezcla anterior. Posteriormente, la mezcla enfriada se vertió lentamente en moldes cilíndricos prefabricados o en un parche microfluídico ensamblado y se solidificó durante 10 min a 4 °C. El gel del cátodo se preparó de manera similar excepto que se usó NaCl (1% p/p) en lugar de carbacol.

El diagrama de bloques del sistema electrónico (Fig. 1g y Fig. 4 complementaria) representa tanto el parche electrónico portátil como el reloj inteligente que puede (1) inducir el sudor mediante iontoforesis y (2) monitorear el sudor mediante métodos electroquímicos. Los procedimientos de inducción y detección de sudor son iniciados y controlados por el microcontrolador (STM32L432KC, STMicroelectronics) cuando recibe un comando de usuario del módulo Bluetooth a través de la comunicación universal receptor-transmisor asíncrono (UART).

La corriente iontoforética programable se genera mediante una fuente de corriente controlada por voltaje que consta de un amplificador de diferencia de ganancia unitaria (AD8276, Analog Devices) y un transistor elevador (BC846, ON Semiconductor). El circuito es alimentado por la salida de un convertidor elevador (LMR64010) que aumenta el voltaje de la batería de 3,7 V a 36 V. El microcontrolador controla el convertidor de digital a analógico (DAC) (DAC8552, Texas Instruments) a través de una interfaz periférica en serie para establecer el voltaje de control de la fuente de corriente. La salida de la fuente de corriente se comprueba mediante un comparador (TS391, STMicroelectronics), y el microcontrolador se interrumpe a través de su pin de entrada/salida de uso general en caso de fallo de salida. El circuito de protección consta de un limitador de corriente (MMBF5457, ON Semiconductor) e interruptores analógicos (MAX4715, Maxim Integrated; ADG5401, Analog Devices). La entrada/salida de propósito general del microcontrolador también se usa para habilitar o deshabilitar el circuito de iontoforesis. Para el diseño optimizado, se aplicó una corriente de 100 µA (~2,6 µA mm−2) para la inducción de sudor por iontoforesis en el cuerpo utilizando el parche microfluídico flexible.

Cuando se alimenta a 3,3 V, el sistema electrónico consume ~28 mA durante una medición electroquímica activa y ~61 mA durante la iontoforesis. El microcontrolador y el módulo Bluetooth consumen ~12 mA cada uno; la interfaz del sensor consume ~4 mA; el convertidor elevador y el módulo de iontoforesis consumen ~33 mA; y el módulo de visualización consume ~8 mA adicionales al actualizar su pantalla.

El circuito de detección de sudor puede realizar DPV simultáneo de dos canales, así como mediciones potenciométricas y de temperatura. Un circuito de bipotenciostato está construido por un amplificador de control (AD8605) y dos amplificadores de transimpedancia (AD8606). Se utiliza una referencia de voltaje en serie (ISL60002, Renesas Electronics) y un DAC (DAC8552, Texas Instruments) para generar una polarización potencial dinámica entre los electrodos de referencia y de trabajo. Se utiliza un amplificador de instrumentación (INA333, Texas Instruments) para las mediciones potenciométricas y un divisor de voltaje para el sensor de temperatura resistivo. Todas las señales de voltaje analógicas son adquiridas por los canales del convertidor de analógico a digital (ADC) incorporado del microcontrolador, procesadas y luego transmitidas a través de Bluetooth a un dispositivo de usuario.

La aplicación móvil personalizada se desarrolló con el marco Flutter multiplataforma. La aplicación móvil puede comunicarse de forma inalámbrica con los dispositivos portátiles a través de Bluetooth para enviar comandos y adquirir, procesar y visualizar los niveles de biomarcadores de sudor. La aplicación establece una conexión Bluetooth segura con el sensor portátil. La página de inicio traza los niveles históricos de biomarcadores del usuario y destaca las concentraciones de analitos medidas más recientemente. Cuando se solicita una medición de biomarcador de sudor, el usuario puede cambiar a la página de medición que traza los voltamogramas de los sensores de sudor en tiempo real. Después de la medición voltamperométrica, la aplicación extrae las corrientes máximas de los voltamogramas utilizando un algoritmo de corrección de línea de base personalizado y luego convierte las corrientes máximas en concentraciones de biomarcadores correspondientes. Estos datos de medición se agregan a la lista de niveles históricos de analitos en la página de inicio.

Los análisis del tiempo de refresco se realizaron mediante simulaciones numéricas (COMSOL). Se crearon modelos tridimensionales de diferentes diseños de microfluidos con las mismas dimensiones del dispositivo real en Rhinoceros y se importaron a COMSOL Multiphysics. El proceso de transporte de masa se simuló resolviendo numéricamente la ecuación de Stokes para un flujo incompresible junto con la ecuación de convección-difusión (Nota complementaria 3).

La validación y evaluación del sensor de sudor se realizaron con sujetos humanos de conformidad con todas las normas éticas de los protocolos (ID 19-0892 y 21-1079) que fueron aprobados por la junta de revisión institucional del Instituto de Tecnología de California. Los sujetos participantes (mayores de 18 años) fueron reclutados del campus del Instituto de Tecnología de California y de las comunidades vecinas a través de publicidad. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. Para la evaluación del sensor portátil, se reclutaron sujetos sanos con un índice de masa corporal (IMC) de 18,5 a 24,9 kg m-2 con glucosa sérica en ayunas <100 mg dl-1. Para el estudio BCAA, los criterios de inclusión incluyen: grupo I, individuos con peso normal que tienen un IMC de 18,5-24,9 kg m-2 con glucosa sérica en ayunas <100 mg dl-1 (sanos); grupo II, individuos con sobrepeso/obesidad que tienen un IMC de 25-35 kg m−2 y glucosa sérica en ayunas <6 mg dl−1 (sobrepeso/obesidad); grupo III, individuos con obesidad que tienen un IMC de 25-35 kg m−2 y glucosa sérica en ayunas ≥126 mg dl−1 (obesidad y DM2). Las muestras de suero positivas para COVID-19 y negativas para COVID-19 se compraron de RayBiotech.

El análisis GC-MS de los AA en muestras de sudor y suero se realizó con el kit EZ:Faast de Phenomenex, que permite la preparación de muestras, la derivatización y el análisis GC-MS de AA libres. Se utilizó un Varian Saturn 2000 para las ejecuciones de GC-MS. Se inyectó un microlitro de solución de muestra preparada para GC en gas portador de helio a 1,0 ml min−1 de flujo constante con una presión de pulso de 20 libras por pulgada cuadrada durante 0,2 min, con el horno programado de 110 °C a 320 °C a 32 °C min−1. La cromatografía de masas se configuró con fuente a 240 °C, cuádruple a 180 °C y auxiliar a 310 °C con un rango de exploración de 45–450 m/z a una frecuencia de muestreo de 3,5 exploraciones s−1. Se utilizó el monitoreo de iones seleccionados, que registra la corriente de iones en masas seleccionadas que son características de cierto AA en un tiempo de retención esperado49. Por ejemplo, después de la derivatización del kit EZ:Faast, Trp tiene una masa característica de 130 con un tiempo de retención de alrededor de 5,1 min, y la altura del pico se registra para las mediciones de Trp en el número de iones 130 y a los 5,1 min del espectro de datos sin procesar. . El estándar interno (IS; norvalina) se agregó durante el proceso de derivatización de la muestra para tener en cuenta el posible aumento inducido por la evaporación en la detección de picos; la altura del pico de norvalina IS se registra en su número de iones 158 a los 1,65 min (Fig. 26 complementaria). La altura del pico de Trp registrada a partir del espectro de datos sin procesar se calibró con respecto al IS en la misma ejecución: altura del pico de Trp normalizada = altura del pico de Trp/altura del pico de IS. Con alturas de pico normalizadas de diferentes niveles de patrones de Trp, se construyeron parcelas de calibración. Para otras muestras, se utilizó la altura máxima normalizada de Trp para calcular la concentración.

Para validar el sistema de sensor portátil, realizamos ejercicio de ciclismo de carga constante en sujetos sanos. Los sujetos se presentaron en el laboratorio después de ayunar durante la noche y se les administró una bebida proteica estandarizada (Fairlife, Core Power Elite). La frente y el cuello de los sujetos se limpiaron con hisopos con alcohol y gasas antes de colocar los parches sensores en el cuerpo. Para las pruebas de ciclismo se utilizó una bicicleta estática (Kettler Axos Cycle M-LA). Los sujetos pedalearon a 60 rpm durante 60 min o hasta la fatiga. Durante la prueba en el cuerpo, los datos de los parches del sensor se enviaron de forma inalámbrica a la interfaz de usuario a través de Bluetooth. Cuando los sujetos comenzaron a andar en bicicleta, el sistema de sensores adquirió y transmitió continuamente datos del sensor de temperatura y sodio. Cada minuto, el sistema electrónico iniciaba una polarización transitoria de voltaje entre los electrodos de referencia y de trabajo. Cuando el sesgo activaba una corriente por encima de un umbral determinado experimentalmente, el sistema iniciaba un ciclo de limpieza de CV y luego el primer escaneo DPV como fondo inicial sin incubación objetivo. La exploración DPV se repitió 7 min más tarde como la curva posterior a la incubación. Entre los dos escaneos, los datos del sensor de sodio y temperatura se registraron continuamente. Inmediatamente después de la DPV posterior a la incubación, comenzó otro ciclo con un paso de limpieza/regeneración de TI, seguido de una exploración DPV de fondo inicial. Los datos recopilados de temperatura, sodio y DPV se transmitieron de forma inalámbrica a un dispositivo de usuario a través de Bluetooth en tiempo real, donde los datos moleculares se extrajeron, calibraron y convirtieron a niveles de concentración. Se recogieron periódicamente muestras de sudor de los sujetos durante los estudios utilizando tubos centrífugos. Luego, las muestras de sudor se congelaron a -20 °C para realizar más pruebas y validaciones mediante pruebas electroquímicas con biosensores y análisis GC-MS.

Los sujetos se reportaron al laboratorio después de ayunar durante la noche. Los brazos de los sujetos se limpiaron con hisopos con alcohol y gasas antes de colocar los parches sensores en el cuerpo. Los sujetos recibieron suplementos de Tyr y Trp (1 g cada uno) para el estudio de ingesta. Por el contrario, el estudio de control se realizó en los sujetos sin ninguna ingesta suplementaria. Se aplicó iontoforesis de cinco minutos a los sujetos. El proceso de registro de datos del sensor fue el mismo que en las pruebas con humanos basadas en el ejercicio.

Para los estudios de BCAA, se pidió a los sujetos que consumieran 5 g de BCAA (2:1:1 Leu:Ile:Val) o un refrigerio estandarizado que incluyera una bebida proteica (Fairlife, Core Power Elite) y una barra energética CLIF. Se implementó una sesión de iontoforesis con geles de carbacol para la inducción del sudor. Durante todo el período de estudio, el sudor del sujeto fue muestreado periódicamente y analizado por el parche sensor. El nivel de glucosa en sangre se registró cada 15 minutos con un medidor de glucosa en sangre Care Touch comercial. Se recogieron muestras de sangre capilar fresca mediante un método de punción digital durante los estudios en humanos. Después de limpiar la yema del dedo con una toallita con alcohol y dejar que se secara al aire, se perforó la piel con un dispositivo de punción CareTouch. Las muestras se recogieron con tubos de centrífuga después de limpiar la primera gota de sangre con una gasa. Una vez finalizado el procedimiento de coagulación estandarizado de 90 minutos, el suero se separó mediante centrifugación a 6000 rpm durante 15 minutos y se almacenó instantáneamente a -20 °C para su análisis con GC-MS, los sensores LEG-MIP y el ensayo de insulina personalizado.

Para el estudio de desafío de la dieta BCAA, las muestras de suero recolectadas se analizaron utilizando un inmunoensayo de sándwich de insulina personalizado. Los MB fueron modificados sobre la base de una publicación anterior50. Brevemente, se activaron 3 μl de MB con 50 mg ml-1 de EDC/sulfo-NHS en tampón MES (25 mM, pH 5) durante 35 min, seguido de la inmovilización del anticuerpo de captura (25 μg ml-1 en tampón MES) durante 15 min. Después de la desactivación con etanolamina 1 M en tampón de fosfato (0,1 M, pH 8), los MB se incubaron en 25 μl de estándares preparados en BSA al 1 % o muestras de suero diluidas cinco veces en BSA al 1 % durante 15 min. A partir de aquí, las perlas se enjuagaron dos veces con BSA al 1 % después de cada paso de unión. A continuación, los MB se incubaron en 25 μl de anticuerpo detector de biotina (1,0 μg ml-1) en BSA al 1 % durante 30 min, seguido de 15 min en conjugado de estreptavidina-peroxidasa (2500x) preparado en BSA al 1 %. La detección amperométrica se llevó a cabo aplicando un potencial constante de -0,2 V a los MB resuspendidos en 45 μl de hidroquinona 1 mM, y se pipetearon 5 μl de H2O2 5 mM sobre los electrodos de carbono serigrafiados cuando se estabilizó la corriente de fondo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los principales datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos fuente para las Figs. 4 y 5 y para las Figs. complementarias. 36 y 39–41 se proporcionan con este documento. Todos los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este proyecto fue apoyado por la subvención R01HL155815 de los Institutos Nacionales de Salud, las subvenciones de la Oficina de Investigación Naval N00014-21-1-2483 y N00014-21-1-2845, el Instituto de Investigación Traslacional para la Salud Espacial a través de la NASA NNX16AO69A, el Acuerdo de Cooperación de la NASA 80NSSC20M0167, Premio de Investigación Piloto de Alto Impacto T31IP1666 y subvención R01RG3746 del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco, Subvención Piloto de Iniciativa Biomédica de Caltech-City of Hope y el Programa de Iniciativa de Innovación Rothenberg en el Instituto de Tecnología de California. JT recibió el apoyo de la Beca Nacional de Ciencias (NSS) de la Agencia de Ciencia, Tecnología e Investigación (A*STAR) de Singapur. Reconocemos con gratitud el apoyo y la infraestructura críticos proporcionados para este trabajo por el Instituto de Nanociencia Kavli en Caltech. Este proyecto se benefició del uso de instrumentación puesta a disposición por el Centro de análisis ambiental de Caltech, y agradecemos el apoyo en GC-MS de N. Dalleska. También agradecemos a Z. Wang por la contribución al desarrollo de aplicaciones móviles, RM Torrente-Rodríguez por la optimización del ensayo de insulina y S. Bao por las valiosas aportaciones.

Estos autores contribuyeron por igual: Minqiang Wang, Yiran Yang, Jihong Min.

Andrew y Peggy Cherng Departamento de Ingeniería Médica, División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, EE. UU.

Minqiang Wang, Yiran Yang, Jihong Min, Yu Song, Jiaobing Tu, Cui Ye, Changhao Xu y Wei Gao

Departamento de Física Aplicada y Ciencia de los Materiales, División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, EE. UU.

Daniel Mukasa

Departamento de Ingeniería Eléctrica, División de Ingeniería y Ciencias Aplicadas, Instituto de Tecnología de California, Pasadena, CA, EE. UU.

nicole heflin

Departamento de Ciencias Traslacionales de Neoplasias Hematológicas, Instituto de Investigación Beckman en City of Hope, Duarte, CA, EE. UU.

Jeannine S. McCune

División de Cardiología, Facultad de Medicina David Geffen, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Tzung K. Hsiai

División de Nutrición Clínica, Escuela de Medicina David Geffen, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Zhaoping Li

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WG, MW, YY y JM iniciaron el concepto y diseñaron los estudios; WG supervisó el trabajo; MW, YY y JM dirigieron los experimentos y recopilaron los datos generales; YS, JT, DM, CY y CX contribuyeron a la caracterización, validación y análisis de muestras del sensor; NH contribuyó al procesamiento de la señal y al desarrollo de la aplicación. JSM, TKH y ZL contribuyeron al diseño de los estudios humanos. WG, MW, YY y JM coescribieron el documento. Todos los autores contribuyeron al análisis de datos y proporcionaron comentarios sobre el manuscrito.

Correspondencia a Wei Gao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Biomedical Engineering agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Notas complementarias, figuras, tablas y referencias.

Demostración en el cuerpo con el parche y la aplicación de detección diseñados.

Simulación y validación del sudor refrescante microfluídico.

Muestreo de sudor microfluídico inducido por iontoforesis en reposo.

Los datos fuente para las Figs. 4 y 5 y las Figs. complementarias. 36 y 39–41.

Springer Nature o su licenciatario tienen derechos exclusivos sobre este artículo en virtud de un acuerdo de publicación con el autor o los autores u otros titulares de derechos; el autoarchivo del autor de la versión manuscrita aceptada de este artículo se rige únicamente por los términos de dicho acuerdo de publicación y la ley aplicable.

Reimpresiones y permisos

Wang, M., Yang, Y., Min, J. et al. Un biosensor electroquímico portátil para el seguimiento de metabolitos y nutrientes. Nat. biomedicina Inglés 6, 1225–1235 (2022). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00916-z

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Recibido: 07 junio 2021

Aceptado: 19 junio 2022

Publicado: 15 agosto 2022

Fecha de emisión: noviembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00916-z

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