El hidrógeno molecular en el agua de mar favorece el crecimiento de diversas bacterias marinas

Nature Microbiology volumen 8, páginas 581–595 (2023)Citar este artículo

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El hidrógeno molecular (H2) es una fuente de energía abundante y de fácil acceso en los sistemas marinos, pero aún se desconoce si las comunidades microbianas marinas consumen este gas. Aquí usamos un conjunto de enfoques para mostrar que las bacterias marinas consumen H2 para apoyar el crecimiento. Los genes para las hidrogenasas de captación de H2 prevalecen en los metagenomas oceánicos globales, se expresan en gran medida en los metatranscriptomas y se encuentran en ocho filos bacterianos. La capacidad de oxidación de H2 aumenta con la profundidad y disminuye con la concentración de oxígeno, lo que sugiere que el H2 es importante en ambientes con baja producción primaria. Las mediciones biogeoquímicas de aguas tropicales, templadas y subantárticas y cultivos axénicos muestran que los microbios marinos consumen H2 suministrado en concentraciones ambientalmente relevantes, lo que produce suficiente energía específica para las células para apoyar el crecimiento de bacterias con bajos requisitos de energía. Por el contrario, nuestros resultados indican que la oxidación del monóxido de carbono (CO) respalda principalmente la supervivencia. En conjunto, el H2 es una fuente de energía notable para las bacterias marinas y puede influir en la ecología y la biogeoquímica oceánicas.

Durante la última década, los gases traza se han convertido en las principales fuentes de energía que respaldan el crecimiento y la supervivencia de las bacterias aeróbicas en los ecosistemas terrestres. Dos gases traza, el hidrógeno molecular (H2) y el monóxido de carbono (CO), son sustratos especialmente fiables dada su ubicuidad, difusibilidad y rendimiento energético1. Las bacterias oxidan estos gases, incluso por debajo de las concentraciones atmosféricas, utilizando [NiFe]-hidrogenasas del grupo 1 y 2 y deshidrogenasas de monóxido de carbono de la forma I unidas a cadenas respiratorias aeróbicas2,3,4,5,6. La oxidación de gases traza permite que diversas bacterias organoheterótrofas sobrevivan a la inanición a largo plazo de sus sustratos de crecimiento orgánico preferidos7,8. Además, varios microorganismos pueden crecer mixotróficamente mediante la cooxidación de gases traza con otras fuentes de energía orgánicas o inorgánicas7,9,10. Hasta ahora, se ha demostrado experimentalmente que bacterias de ocho filos diferentes consumen H2 y CO a niveles ambientales1, y muchas otras bacterias codifican los determinantes de este proceso6,11. A escala del ecosistema, la mayoría de las bacterias en los ecosistemas del suelo albergan genes para la oxidación de gases traza y las tasas de oxidación de gases traza específicas de las células son teóricamente suficientes para mantener su supervivencia12,13. Sin embargo, dado que la mayoría de estos estudios se han centrado en ambientes de suelo o aislados, la importancia más amplia de la oxidación de gases traza permanece en gran medida sin explorar.

Los gases traza pueden ser fuentes de energía importantes para las bacterias oceánicas, ya que generalmente están disponibles en concentraciones elevadas en relación con la atmósfera, a diferencia de la mayoría de los suelos1. Las capas superficiales de los océanos del mundo generalmente están sobresaturadas con H2 y CO, típicamente de 2 a 5 veces (hasta 15 veces) y de 20 a 200 veces (hasta 2000 veces) en relación con la atmósfera, respectivamente14, 15,16,17. Como resultado, los océanos contribuyen a las emisiones atmosféricas netas de estos gases18,19. El CO se produce principalmente a través de la oxidación fotoquímica de la materia orgánica disuelta20, mientras que el H2 se produce principalmente por la fijación de nitrógeno por cianobacterias21. También se producen altas concentraciones de H2 durante la fermentación en sedimentos hipóxicos, y estas altas concentraciones pueden difundirse en la columna de agua suprayacente, especialmente en las aguas costeras22. Por razones no resueltas, las distribuciones de estos gases varían con la latitud y muestran tendencias opuestas: mientras que el CO disuelto está muy sobresaturado en las aguas polares, el H2 suele estar subsaturado23,24,25,26,27,28. Estas variaciones probablemente reflejan diferencias en las tasas relativas de producción y consumo de gases traza en diferentes climas.

Hace tiempo que se sabe que las comunidades microbianas oceánicas consumen CO, aunque no se ha evaluado sistemáticamente su capacidad para utilizar H229. Aproximadamente una cuarta parte de las células bacterianas en las aguas superficiales oceánicas codifican CO deshidrogenasas en las aguas superficiales y estas abarcan una amplia gama de taxones, incluida la familia Rhodobacteraceae, abundante en todo el mundo (anteriormente conocida como el clado Roseobacter marino)6,30,31,32,33. Sobre la base de las observaciones realizadas para las comunidades del suelo, la oxidación de CO mejora potencialmente la supervivencia a largo plazo de las bacterias marinas durante los períodos de escasez de carbono orgánico6; consistentemente, los estudios basados ​​en cultivos indican que el CO no influye en el crecimiento de los aislados marinos, pero la producción de las enzimas responsables se regula fuertemente durante la inanición34,35,36,37. Si bien la oxidación aeróbica y anaeróbica de H2 se ha descrito ampliamente en comunidades de respiraderos bentónicos e hidrotermales38,39,40,41,42, hasta el momento ningún estudio ha demostrado si las comunidades de bacterias pelágicas pueden utilizar este gas. Varios estudios han detectado hidrogenasas oxidantes de H2 potenciales en muestras y aislamientos de agua de mar6,11,40,43. Aunque se ha informado que las cianobacterias oxidan H2, incluidos los aislados marinos como Trichodesmium, se cree que este proceso se limita al reciclaje endógeno de H2 producido por la reacción de la nitrogenasa44,45.

En este estudio, abordamos estas lagunas de conocimiento investigando los procesos, la distribución, los mediadores y las funciones potenciales de la oxidación de H2 y CO por bacterias marinas. Para hacerlo, realizamos perfiles biogeoquímicos y metagenómicos lado a lado de 14 muestras recolectadas de un transecto oceánico templado, un transecto costero templado y una isla tropical, además de analizar los metagenomas y metatranscriptomas globales de Tara Oceans46. También probamos la capacidad de tres aislados bacterianos marinos axénicos para consumir aeróbicamente H2 atmosférico. En conjunto, proporcionamos pruebas definitivas a escala de ecosistemas y basadas en cultivos de que el H2 es una fuente de energía clave que se pasa por alto y apoya el crecimiento de bacterias marinas.

Medimos las concentraciones in situ y las tasas de oxidación ex situ de H2 y CO en 14 muestras de agua de mar superficial. Las muestras se recolectaron en tres ubicaciones (Fig. 1 complementaria): un transecto oceánico que abarca aguas frontales neríticas, subtropicales y subantárticas (transecto Munida frente a la costa de Nueva Zelanda; n = 8; Fig. 2 complementaria); una bahía urbana templada (Port Phillip Bay, Australia; n = 4); y un cayo de coral tropical (Isla Heron, Australia; n = 2). De acuerdo con las tendencias globales en estas latitudes, ambos gases estaban sobresaturados en relación con la atmósfera en todas las muestras. El H2 estaba sobresaturado en 5,4, 4,8 y 12,4 veces, respectivamente, en el transecto oceánico (2,0 ± 1,2 nM), la bahía templada (1,8 ± 0,26 nM) y la isla tropical (4,6 ± 0,3 nM). El CO estuvo moderadamente sobresaturado en el transecto oceánico (5,2 veces; 0,36 nM ± 0,07 nM), pero muy sobresaturado tanto en la bahía templada (123 veces; 8,5 ± 1,7 nM) como en la isla tropical (118 veces; 8,2 ± 0,93 nM) ).

Se detectó oxidación microbiana de gases traza en todas menos una de las muestras recolectadas durante las incubaciones ex situ (Fig. 1). Para la bahía templada, se consumieron H2 y CO en las muestras de agua recolectadas de la costa, la zona intermedia y el centro de la bahía (Fig. 1a). Según las concentraciones de gas in situ, las tasas de oxidación a granel de CO fueron 18 veces más rápidas que las de H2 (P < 0,0001) (Tabla complementaria 1). Las tasas de oxidación a granel no difirieron significativamente entre la microcapa superficial (es decir, la interfaz de 1 mm entre la atmósfera y el océano) y las aguas subyacentes. La oxidación de H2 y CO también fue evidente en la microcapa superficial y en las muestras de agua de mar subyacentes recolectadas en la isla tropical (Fig. 3 complementaria). De manera similar, observamos un consumo rápido de CO y un consumo más lento de H2 a lo largo del transecto oceánico de múltiples frentes de Munida, aunque inesperadamente, estas actividades fueron mutuamente excluyentes. La oxidación neta de CO se produjo en las aguas costeras y subtropicales, pero fue insignificante en las aguas subantárticas. Por el contrario, la oxidación neta de H2 solo ocurrió en las aguas subantárticas (Fig. 1b). Estas tasas de oxidación divergentes en masas de agua con condiciones fisicoquímicas contrastantes pueden ayudar a explicar las concentraciones contrastantes de H2 y CO en el agua de mar global23,24,25,26,27,28, aunque se requerirían muestreos más amplios y ensayos in situ para confirmar esto. Cabe señalar que estas mediciones probablemente subestiman las tasas y sobrestiman los umbrales de oxidación de H2, ya que aún habrá una producción endógena subyacente de H2, principalmente a través de la fijación de nitrógeno, durante las incubaciones. Sin embargo, proporcionan el primer informe empírico de oxidación de H2 en columnas de agua marina.

a,b, se muestran los resultados de cuatro muestras en un transecto en Port Phillip Bay, Victoria, Australia (a) y ocho muestras en el transecto de Munida frente a la costa de Otago, Nueva Zelanda (b). Cada vial de suero sellado de 120 ml contenía 60 ml de muestras de agua de mar nativa incubadas en un espacio de cabeza de aire ambiente de 60 ml complementado con ~2,5 ppmv H2 o CO. En cada punto de tiempo, se midió la relación de mezcla de cada gas en el espacio de cabeza de cada vial en un cromatógrafo de gases y convertido a concentraciones de gas disuelto (nM). Los datos se presentan como media ± sem de tres muestras biológicamente independientes.

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Para comprender mejor la base de estas actividades, secuenciamos los metagenomas de las 14 muestras (Tablas complementarias 2 y 3) y utilizamos búsquedas basadas en homología para determinar la abundancia de 50 genes marcadores metabólicos en las lecturas metagenómicas (Tabla complementaria 3) y ensamblajes ( Tabla complementaria 4). Al igual que otras comunidades de agua de mar superficial47, el análisis de la composición de la comunidad (Fig. 4 complementaria) y los genes metabólicos (Fig. 2) sugiere que la mayoría de las bacterias presentes son capaces de respiración aeróbica, organoheterotrofia y fototrofia a través de rodopsinas convertidoras de energía. La capacidad para la oxidación aeróbica de CO fue moderada: aproximadamente el 12 % de las células bacterianas y arqueas codificaron el gen coxL (que codifica la subunidad catalítica de la forma I CO deshidrogenasa), aunque la abundancia relativa disminuyó de un promedio de 25 % en la bahía templada donde la oxidación de CO fue altamente activo al 5,1% en aguas subantárticas (Fig. 2) donde la oxidación de CO fue insignificante (Fig. 1). La comunidad también codificó diversas hidrogenasas, incluidos los subgrupos conocidos por apoyar la respiración hidrogenotrófica, la fijación hidrogenotrófica de carbono, la fermentación hidrogenógena y la detección de H2 (Tabla complementaria 3). Las hidrogenasas [NiFe] de los grupos 1d, 1l y 2a (en este documento, hidrogenasas de captación de H2 aeróbicas), que permiten a las células introducir electrones de H2 en la cadena respiratoria aeróbica4,9,48,49, fueron con mucho las más abundantes entre las H2- enzimas oxidantes (Fig. 2). Codificados en promedio por el 1,0 % de las bacterias marinas, la abundancia de estos subgrupos de hidrogenasa fue mayor en las muestras de islas tropicales (promedio de 3,5 %) y disminuyó al 0,11 % en las muestras neríticas y subtropicales del transecto oceánico (Fig. 2), en en línea con las tasas de oxidación de H2 contrastantes entre estas muestras (Fig. 1 y Fig. 3 complementaria). Los subgrupos de hidrogenasa dominantes variaron entre las muestras, a saber, el grupo 1d en las muestras de islas tropicales, el grupo 2a en las muestras de la costa templada y las microcapas y el grupo 1l en las muestras subantárticas (Fig. 2). La abundancia relativa de bacterias oxidantes de H2 y CO predijo fuertemente las tasas de oxidación de cada gas (R2 de 0,55 y 0,88; valores de P de 0,0059 y <0,0001, respectivamente) (Figura 5 complementaria), aunque es probable que la represión de la expresión génica contribuye a las actividades insignificantes de algunas muestras.

La abundancia de genes marcadores metabólicos se muestra sobre la base de lecturas cortas metagenómicas en el agua de mar muestreada de los tres sitios de estudio (izquierda; n = 14), lecturas cortas metagenómicas del conjunto de datos de Tara Oceans (centro; n = 213; réplicas promediadas ) y lecturas cortas metatranscriptómicas del conjunto de datos Tara Oceans (derecha; n = 89; réplicas promediadas). Se utilizaron búsquedas basadas en homología para calcular la abundancia relativa de genes marcadores como copias de genes promedio por organismo para los metagenomas (abundancia relativa a un conjunto de genes marcadores universales de una sola copia; equivalente a la proporción estimada de la comunidad que codifica un gen dado como una sola copia) y RPKM para los metatranscriptomas. Cuando se enumeran múltiples genes marcadores, los valores se suman. Los paneles inferiores muestran los subgrupos de hidrogenasa presentes en cada muestra. SUR, superficie; DCM, máximo profundo de clorofila; MES, capas oceánicas mesopelágicas.

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Para probar si estas observaciones eran representativas a nivel mundial, determinamos la distribución y expresión de los genes para la oxidación de H2 y CO en el conjunto de datos de Tara Oceans47,50. De manera similar a nuestros metagenomas, las hidrogenasas aeróbicas de captación de H2 fueron codificadas por un promedio de 0,8 % de bacterias y arqueas en los 213 metagenomas de Tara Oceans, mientras que las deshidrogenasas de forma I CO fueron codificadas por un 10,4 %. Estos genes se observaron en muestras que abarcaban los cuatro océanos, así como el Mar Rojo y el Mar Mediterráneo (Fig. 2). A pesar de su abundancia relativamente baja según los metagenomas, las transcripciones de hidrogenasa eran muy numerosas en los metatranscriptomas, con niveles comparables a las transcripciones de nitrogenasa (nifH) (Fig. 2 y Tabla complementaria 3). Las proporciones de expresión (proporción promedio de ARN: ADN) de las hidrogenasas de absorción de H2 aeróbicas fueron altas, es decir, 2.2, 1.1 y 12.9 para las hidrogenasas [NiFe] del grupo 1d, 1l y 2a, respectivamente (Tabla complementaria 3); de los genes marcadores examinados, solo los determinantes de fototrofia (psaA, psbA, rodopsinas convertidoras de energía), nitrificación (amoA, nxrA) y fijación de CO2 (rbcL) se expresaron en proporciones más altas que las hidrogenasas [NiFe] del grupo 2a. Por el contrario, los niveles de expresión fueron relativamente bajos para la CO deshidrogenasa (0,9), así como para las hidrogenasas responsables de la fijación de carbono hidrogenotrófico, la fermentación hidrogenogénica y la detección de H2 (promedio de ARN/ADN <1 en todos los casos) (Tabla complementaria 3). Junto con las mediciones biogeoquímicas (Fig. 1), estos hallazgos sugieren que las bacterias oxidantes de H2 pueden ser muy activas en el agua de mar a pesar de su abundancia relativamente baja.

Posteriormente, determinamos la distribución de los genes marcadores metabólicos en 110 genomas ensamblados en metagenoma (MAG) construidos a partir del conjunto de datos local y 1888 MAG informados previamente (Fig. 3a y Fig. 6 complementaria) del conjunto de datos de Tara Oceans (Fig. 3a). Los tres linajes de hidrogenasas aeróbicas de absorción de H2 estaban filogenéticamente extendidos, codificados por 75 (4,0 %) de las MAG bacterianas, abarcando 9 filos y 26 órdenes, mientras que las deshidrogenasas de CO tenían una distribución algo más estrecha, es decir, 70 (3,5 %) de MAG. , 6 filos y 14 órdenes (Tabla complementaria 5). Las hidrogenasas aeróbicas de absorción de H2 y las deshidrogenasas de CO fueron codificadas por MAG dentro de Proteobacteria, Bacteroidota, Actinobacteriota, Chloroflexota, Myxococcota y el filo candidato SAR324, y las hidrogenasas también estaban presentes en MAG de Cyanobacteria, Planctomycetota y Eremiobacterota (Fig. 3a). Los árboles filogenéticos representan la historia evolutiva y las distribuciones taxonómicas de las subunidades catalíticas de las hidrogenasas del grupo 1 y 2 [NiFe] oxidantes de H2 (Fig. 3b y Fig. 7 complementaria), hidrogenasas bidireccionales del grupo 3 y 4 [NiFe] (Suplementaria Fig. 8) y CO deshidrogenasa (Fig. 9 complementaria).

a, Gráfica de burbujas que muestra el potencial metabólico de los genomas ensamblados en el metagenoma construidos a partir de los tres sitios de estudio (110 MAG) e informados previamente para el conjunto de datos de Tara Oceans (1877 MAG). Los MAG se resumen a nivel de phylum, con el tamaño del círculo correspondiente a la cantidad de genomas en ese phylum con un gen dado, y el color que refleja el porcentaje de integridad del genoma. Se omiten los genes marcadores que no se detectaron en ningún MAG. b, Árbol filogenético de máxima verosimilitud de la subunidad catalítica de las hidrogenasas [NiFe] del grupo 1 y 2. Las secuencias de hidrogenasa recuperadas de los nuevos MAG (de color verde) y Tara MAG (de color azul) se muestran junto con las secuencias de referencia representativas (de color amarillo), incluidas las tres bacterias marinas cultivadas (nombres en rojo). La historia evolutiva se infirió usando el modelo basado en matriz JTT, el árbol se arrancó usando 50 repeticiones y el árbol se arraigó usando la secuencia de hidrogenasa [NiFe] del grupo externo 4a. El árbol incluye subgrupos de hidrogenasa implicados en la respiración aeróbica (grupos 1d, 1f, 1l, 2a), respiración anaeróbica (grupos 1a, 1b, 1c, 1e) y detección de H2 (grupos 2b y 2c).

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Al integrar la información genómica con la literatura más amplia, es probable que la oxidación de H2 y CO sea compatible con una miríada de estilos de vida en los ecosistemas marinos. El grupo 1d [NiFe]-hidrogenasa se codificaba típicamente con ribulosa 1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) y el grupo sensorial 2b [NiFe]-hidrogenasa en las MAG de múltiples Rhodobacteraceae, Alteromonadaceae y otras proteobacterias (Fig. .3b y Tabla Suplementaria 5); esto sugiere que esta enzima favorece el crecimiento hidrogenotrófico en aguas enriquecidas con H2, en consonancia con las funciones descritas anteriormente de estas hidrogenasas en estudios basados ​​en cultivos11,38,51. El grupo 1l [NiFe]-hidrogenasa, recientemente demostrado que respalda la persistencia de un aislado de Bacteroidota de suelos salinos antárticos4, fue codificado por organoheterótrofos predichos de Bacteroidota, SAR324 y, sobre la base de aislados cultivados, Proteobacteria (Fig. 3b y Tabla complementaria 5). Las [NiFe]-hidrogenasas del grupo 2a, conocidas por apoyar el crecimiento mixotrófico de diversas bacterias9, eran filogenéticamente más diversas y taxonómicamente más extendidas; se distribuyeron en los MAG de quimioorganoheterótrofos predichos (Bacteroidota, Myxococcota, Proteobacteria) y fotolitoautótrofos (Cyanobacteria) (Fig. 3b y Tabla complementaria 5). Las CO deshidrogenasas estaban afiliadas principalmente a Rhodobacteraceae y también fueron codificadas por múltiples MAG de las clases Nanopelagicales S36-B12, Puniceispirillaceae, SAR324 NAC60-12 e Ilumatobacteraceae (Fig. 9 complementaria). De los MAG que codifican coxL, el 63 % también codificó los genes para las rodopsinas convertidoras de energía o el fotosistema II, lo que indica que pueden recolectar energía al mismo tiempo o alternativamente tanto del CO como de la luz, lo que respalda hallazgos previos basados ​​en cultivos37. Si bien se predice que la mayoría de estos MAG son heterótrofos obligados, el 7% también codificó RuBisCO y, por lo tanto, teóricamente son capaces de un crecimiento carboxidotrófico (Tabla complementaria 5). Estos hallazgos respaldan inferencias anteriores de que los hábitats generalistas en aguas marinas se benefician de la flexibilidad metabólica, incluido el consumo de CO2 disuelto como fuente de energía suplementaria31,52.

Utilizamos dos cálculos de modelos termodinámicos para estimar en qué medida las tasas medidas de oxidación de H2 y CO sustentan el crecimiento o la supervivencia celular. En primer lugar, suponiendo una energía de mantenimiento mediana de 1,9 × 10−15 vatios (W) por celda según las mediciones de aislados en su mayoría copiotróficos53, las tasas de oxidación medidas teóricamente sustentarían un promedio de 2,0 × 107 células oxidantes de H2 (rango de 1,4 × 106 a 8,3 × 107) y 6,1 × 107 células oxidantes de CO (rango de 2,1 × 106 a 1,5 × 108) por litro en concentraciones de gas disuelto in situ (Tabla complementaria 1). En segundo lugar, calculamos la cantidad de energía (es decir, W por celda) generada sobre la base de las tasas observadas de oxidación de gases traza (Fig. 1 y Tabla complementaria 1) y el número previsto de oxidantes de gases traza (Fig. 2 y Tabla complementaria). Tabla 1) en las aguas muestreadas, limitándose este análisis a las muestras en las que se observó oxidación y se dispone de recuentos celulares fiables. En promedio, la oxidación de las concentraciones medidas in situ de CO y H2 produce 7,2 × 10-16 W y 5,8 × 10-14 W por celda (Fig. 4). Juntos, estos análisis sugieren que las tasas de oxidación de CO son suficientes para sostener la supervivencia, pero no el crecimiento, de las numerosas bacterias que se prevé que sean capaces de usar este gas; esto respalda las inferencias anteriores de que la CO deshidrogenasa respalda principalmente la persistencia en bacterias organoheterótrofas6.

a,b, Los resultados muestran las tasas de oxidación a granel (izquierda) y los rendimientos de energía por celda (derecha) para la oxidación de CO (a) (n = 10 (tasa) y n = 7 (potencia) muestras biológicamente independientes) y la oxidación de H2 ( b) (n = 7 (tasa) y n = 4 (potencia) muestras biológicamente independientes). Este análisis solo se realizó para muestras en las que la oxidación de gases traza era medible y la potencia específica de la célula solo se calculó para muestras en las que se dispone de recuentos de células procarióticas. Las tasas y la potencia se muestran sobre la base de las concentraciones de CO y H2 en un rango de concentraciones ambientalmente relevantes. Los valores centrales muestran las medianas, los recuadros muestran los cuartiles superior e inferior y los bigotes muestran los valores máximo (cuartil superior más 1,5 veces el rango intercuartílico) y mínimo (cuartil inferior menos 1,5 veces el rango intercuartílico).

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Por el contrario, los oxidantes de H2 marinos ganan mucho poder al oxidar un sustrato relativamente exclusivo a tasas rápidas específicas de células, probablemente suficientes para apoyar el crecimiento. La energía específica de la célula generada para la muestra con los oxidantes de H2 más activos (5,4 × 10-13 W; de la primera estación subantártica) está dentro del rango informado para las tasas metabólicas celulares de los aislados bacterianos durante el crecimiento (mediana: 2,6 × 10- 14 W; rango: 2,8 × 10−17 a 2,1 × 10−11 W), y es mayor que la de los aislamientos marinos copiotróficos Vibrio sp. DW1 (3,2 × 10-14 W) y V. anguillarum (1,8 × 10-13 W)53. Si bien la estimación de la potencia específica de las células a partir de los datos de la comunidad es menos precisa que las estimaciones derivadas del cultivo axénico, estos cálculos de potencia por célula probablemente estén subestimados, dado que no tienen en cuenta ningún ciclo interno de gases traza, suponga que todas las células son igualmente activas. y no considere ADN reliquia. También se debe tener en cuenta que la energía ganada por celda aumentará sustancialmente cuando el H2 y el CO se elevan transitoriamente en el espacio y el tiempo, como se muestra en la Fig. 4. En combinación con las inferencias genómicas de que múltiples MAG codifican hidrogenasas que se sabe que soportan litoautotróficas y litoheterótrofas. crecimiento (Fig. 3), tal modelo termodinámico sugiere fuertemente que una pequeña proporción de bacterias en los océanos puede crecer utilizando H2 como donante de electrones para la respiración aeróbica y, en algunos casos, la fijación de CO2. Al depender predominantemente de la energía derivada de la oxidación de H2, las bacterias marinas podrían potencialmente asignar la mayor parte del carbono orgánico para la biosíntesis en lugar de la respiración, es decir, adoptar un estilo de vida predominantemente litoheterótrofo.

Para comprender mejor los mediadores y las funciones de la oxidación de H2 marino, investigamos la absorción de H2 por tres aislados marinos heterótrofos que codifican hidrogenasas de absorción estrechamente relacionadas con las de los MAG (Fig. 3). Dos cepas, Robiginitalea biformata DSM-15991 (Flavobacteriaceae)54 y Marinovum algicola FF3 (Rhodobacteraceae)55, no consumieron sustancialmente H2 durante un período de 3 semanas en una variedad de condiciones a pesar de codificar hidrogenasas del grupo 1l [NiFe]. No está claro si las hidrogenasas se han vuelto no funcionales en estos aislados de rápido crecimiento adaptados al laboratorio o si, en cambio, solo están activas en condiciones muy específicas. Sphingopyxis alaskensis RB2256 (Sphingomonadaceae)56,57, que codifica una [NiFe]-hidrogenasa del grupo 2a transmitida por plásmidos, consumió H2 aeróbicamente en un proceso cinético de primer orden a niveles subatmosféricos (Fig. 5). Abundante en aguas polares oligotróficas, S. alaskensis requiere recursos mínimos para replicarse, ya que forma células extremadamente pequeñas (<0,1 µm3) y tiene un genoma aerodinámico57,58,59,60. Anteriormente se pensaba que era un organoheterótrofo61 obligado, pero el descubrimiento de que esta bacteria oligotrófica excepcionalmente pequeña (ultramicrobacterium)62 utiliza un abundante gas reducido como fuente de energía racionaliza aún más su éxito ecológico. Este es presumiblemente el primer informe de oxidación de H2 atmosférico por una bacteria marina.

a, Curva de crecimiento de S. alaskensis cultivada en Difco 2216 Marine Broth. Se analizó el consumo de gas de los cultivos y se recolectaron para RT-qPCR en fase exponencial (17 h, OD600 = 0,66) y fase estacionaria (168 h, 4 días después de ODmax). Los datos se presentan como media ± sd, n = 3 muestras biológicamente independientes. b, Número de transcritos del gen de la subunidad grande de [NiFe]-hidrogenasa del grupo 2a (hucL; locus Sala_3198) medido por RT-qPCR en cultivos de fase exponencial y estacionaria de S. alaskensis. Media ± SD de tres réplicas biológicas (promedio de dos duplicados técnicos) por condición. La comparación es estadísticamente significativa sobre la base de una prueba t de dos colas no pareada (**P = 0,0062). c, oxidación de H2 por cultivos en fase exponencial y estacionaria de S. alaskensis. Media ± sd de tres réplicas biológicas, con viales de solo medios monitoreados como controles negativos. La línea punteada muestra la concentración atmosférica de hidrógeno (0,53 ppmv).

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Luego determinamos si S. alaskensis usa la oxidación de H2 principalmente para apoyar el crecimiento o la supervivencia mixotrófica. La expresión de su gen de la subunidad grande de hidrogenasa (hucL) se cuantificó mediante PCR cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR). En condiciones ambientales, este gen se expresó a niveles significativamente más altos (P = 0,006) durante el crecimiento aeróbico en fuentes de carbono orgánico (fase exponencial media; promedio de 2,9 × 107 copias por gdw) que durante la supervivencia (4 días en fase estacionaria; promedio 1,5 × 106 copias por gdw, P = 0,006) (Fig. 5a,b). Este patrón de expresión es similar al de otros organismos que poseen una [NiFe]-hidrogenasa del grupo 2a9 y es antitético al de las [NiFe]-hidrogenasas de los grupos 1h y 1l que normalmente son inducidas por la inanición1. La actividad de la hidrogenasa se controló en las mismas dos condiciones controlando el agotamiento de las proporciones de mezcla de H2 del espacio de cabeza a lo largo del tiempo mediante cromatografía de gases. El H2 se oxidó rápidamente por cultivos en crecimiento exponencial a concentraciones subatmosféricas en un período de 30 h, mientras que se produjo un consumo insignificante en cultivos en fase estacionaria (Fig. 5c). Juntos, estos hallazgos sugieren que S. alaskensis puede crecer mixotróficamente en aguas marinas al consumir simultáneamente H2 disuelto con sustratos orgánicos disponibles. Estos hallazgos se alinean estrechamente con los observados en otros organismos que albergan [NiFe]-hidrogenasas del grupo 2a9,10 y respaldan las inferencias del modelado termodinámico (Fig. 4) de que el H2 probablemente favorece el crecimiento de algunas bacterias marinas.

Finalmente, investigamos los correlatos ambientales de la abundancia y expresión de genes de oxidación de gases traza en los conjuntos de datos de Tara Oceans (Fig. 6 y Tabla complementaria 6). El análisis de correlación lineal confirmó que los genes que codifican la hidrogenasa aeróbica de captación de H2 (R2 = 0,22, P < 0,0001) y la deshidrogenasa de CO (R2 = 0,72, P < 0,0001) aumentaron significativamente con la profundidad (Fig. 6), como se ilustra por su mayor abundancia en los metagenomas de las aguas mesopelágicas (Fig. 2). Esto contrasta con las fuertes disminuciones en los genes responsables de la fototrofia, como las rodopsinas convertidoras de energía (R2 = 0.59, P < 0.0001), con la profundidad (Figs. 2 y 6). Este patrón fue consistente en todos los sitios de los océanos Atlántico, Índico, Pacífico y Austral. Estos hallazgos sugieren que a medida que disminuye la disponibilidad de luz y, por lo tanto, de energía, existe una mayor ventaja selectiva para las bacterias que usan gases traza (litoheterotrofia) en lugar de la fotosíntesis (fotoheterotrofia).

a–c, este análisis se visualiza para las rodopsinas convertidoras de energía (a), las deshidrogenasas de CO (b) y las hidrogenasas de captación de H2 aeróbicas (c). Los paneles superior y medio muestran un modelo de bosque aleatorio de las variables ambientales que mejor predicen la abundancia de genes marcadores en metagenomas y metatranscriptomas, respectivamente. Se muestra la importancia relativa (porcentaje de aumento en el error cuadrático medio, %IncMSE, como medida de disminución en la precisión del modelo) de las diez variables más importantes para cada modelo, además de una variable aleatoria utilizada para comparar la importancia. El panel inferior muestra correlaciones lineales simples entre la abundancia metagenómica de cada gen y la profundidad del agua. Para cada gen, los valores R2 de Pearson muestran bondad de ajuste y los valores P confirman que cada pendiente se desvía significativamente de cero.

Datos fuente

Estas inferencias se matizaron, después de tener en cuenta las variables co-correlacionadas (Fig. 10 complementaria), mediante el modelado de bosque aleatorio (Fig. 6 y Figs. 11 y 12 complementarias). La profundidad se encontraba entre los tres principales predictores más fuertes de la abundancia de hidrogenasas [NiFe] del grupo 1l y 2a, CO deshidrogenasa y rodopsinas convertidoras de energía (Fig. 6 y Fig. 11 complementaria). La latitud demostró ser un fuerte predictor de la expresión del grupo 1l [NiFe]-hidrogenasas y CO deshidrogenasas, esta última alcanzando su punto máximo en los trópicos (Fig. 6 y Figs. Suplementarias 11-13). Una explicación para esto último es que en aguas tropicales, el aumento de la producción de CO fotoquímico y termoquímico mejora la disponibilidad de sustrato para los oxidantes de CO. Estas observaciones son consistentes con las tasas inversas de oxidación de CO y H2 observadas a lo largo del transecto de Munida (Fig. 1), así como con las variaciones latitudinales reportadas previamente en las concentraciones de estos gases en el agua de mar23,24,25,26,27,28. Por el contrario, la abundancia y los niveles de expresión del gen [NiFe]-hidrogenasa del grupo 1d fueron más altos en aguas hipóxicas (Fig. 6 y Fig. 14 complementaria); esto sugiere que, en contraste con sus contrapartes insensibles al oxígeno de alta afinidad, esta hidrogenasa se transcribirá más cuando los niveles de H2 estén elevados debido a la fermentación hipóxica (lo que resulta en la activación de la hidrogenasa sensorial) y será más activa cuando los niveles de O2 sean lo suficientemente bajos como para minimizar inhibición del sitio activo38,51. En conjunto, nuestros análisis sugieren que existen controles ambientales complejos sobre la abundancia y las actividades de los oxidantes de gases traza marinos, y que las tres hidrogenasas de captación de H2 son ecofisiológicamente distintas.

A través de un enfoque integrador, proporcionamos presumiblemente la primera demostración de que el H2 es una fuente de energía importante para las comunidades de agua de mar. Los análisis de modelos biogeoquímicos, metagenómicos y termodinámicos en conjunto sugieren que el H2 es oxidado por una proporción diversa pero pequeña de miembros de la comunidad, pero a tasas específicas de células suficientemente rápidas para permitir el crecimiento litotrófico. Estos hallazgos están respaldados por observaciones experimentales de que la ultramicrobacteria S. alaskensis consume H2 durante el crecimiento heterótrofo. Las bacterias marinas con la capacidad de oxidar H2 probablemente obtengan una gran ventaja competitiva al poder consumir este gas abundante, difusible y de alta energía. Los microorganismos marinos oxidantes de H2 están distribuidos globalmente, aunque las mediciones de actividad y los perfiles de distribución de hidrogenasa sugieren controles complejos sobre su actividad y que pueden ser particularmente activos en aguas con bajo contenido de clorofila. Por el contrario, nuestros hallazgos respaldan que la oxidación de CO es un rasgo generalizado que mejora la flexibilidad y probablemente principalmente la supervivencia de los hábitats generalistas30,31, especialmente en aguas con alto contenido de clorofila. A escala biogeoquímica, nuestros hallazgos indican que las bacterias marinas mitigan las emisiones atmosféricas de H219 y potencialmente explican la subsaturación de H2 en las aguas antárticas28.

Sin embargo, queda un gran enigma. El H2 y el CO se encuentran entre las fuentes de energía más confiables en el mar debido a sus concentraciones y rendimientos energéticos relativamente altos. Entonces, ¿por qué relativamente pocas bacterias los aprovechan? En comparación, los suelos son sumideros netos de estos gases traza dado que las numerosas bacterias presentes los consumen rápidamente12. Proponemos la explicación sencilla de que la inversión en recursos requerida para hacer que las metaloenzimas aprovechen estos gases traza no siempre puede justificarse por la energía obtenida. En el océano con limitaciones agudas de hierro, las hidrogenasas (que contienen de 12 a 13 átomos de Fe por protómero11) y, en menor medida, las deshidrogenasas de CO (que contienen 4 átomos de Fe por protómero63) son una inversión importante. Es probable que esta compensación sea más pronunciada en la superficie del océano, donde la energía solar se puede recolectar usando recursos mínimos a través de las rodopsinas que convierten energía. Sin embargo, la inversión en hierro requerida para consumir H2 y CO probablemente se justifique en aguas con energía limitada en profundidades y regiones o estaciones donde la producción primaria es baja. Esto es consistente con el enriquecimiento observado de hidrogenasas y CO deshidrogenasas en metagenomas de aguas mesopelágicas, así como con el aumento de la oxidación de H2 observado en aguas subantárticas. Además, la disponibilidad de hierro suele ser mayor en aguas circulantes más profundas y alrededor de las plataformas continentales (debido tanto a la surgencia de aguas profundas como a los aportes terrestres), donde se observó una expresión y una actividad elevadas de la hidrogenasa64. Por lo tanto, los océanos continúan siendo una fuente neta de H2 y CO a pesar de la importancia de estas fuentes de energía para diversas bacterias marinas.

Para determinar la capacidad de las comunidades microbianas marinas para oxidar los gases traza, se recolectaron un total de 14 muestras de agua superficial marina de tres lugares diferentes (Figura complementaria 1). Se recolectaron ocho muestras de todo el transecto de la serie temporal del Observatorio microbiano de Munida (Otago, Nueva Zelanda)65 el 23 de julio de 2019 en un clima tranquilo en el RV Polaris II. Este transecto marino comienza frente a la costa de Otago, Nueva Zelanda y se extiende a través de aguas neríticas, subtropicales y subantárticas65. Se tomaron muestras de ocho estaciones equidistantes viajando hacia el este, que van desde aproximadamente 15 km a 70 km de Taiaroa Head. En cada estación, el agua se recolectó a 1 m de profundidad utilizando botellas Niskin y se almacenó en dos botellas de 1 l esterilizadas en autoclave. Una botella se reservó para la filtración y extracción de ADN, mientras que la otra se usó para experimentos de incubación de microcosmos. El barco midió los cambios en la salinidad y la temperatura para determinar los límites de cada masa de agua (Fig. 2 complementaria).

También se recolectaron cuatro muestras de la bahía templada de Port Phillip en Carrum Beach (Victoria, Australia) el 20 de marzo de 2019 y dos de la isla tropical Heron (Queensland, Australia) el 9 de julio de 2019. En ambos sitios, la superficie cercana a la costa Se recolectaron muestras de microcapa y agua superficial en la zona submareal (profundidad del agua aprox. 1 m). En Port Phillip Bay, también se recolectaron dos muestras a 7,5 km y 15 km al este de la desembocadura del río Patterson, etiquetadas como 'Intermedio' y 'Centro' respectivamente. En todos los casos, se recolectaron muestras de agua superficial de 3 l con una botella Schott estéril de aproximadamente 20 cm de profundidad y se dividieron en alícuotas para la incubación del microcosmos y la extracción de ADN. Las muestras de microcapas superficiales se recogieron con un muestreador manual de placa de vidrio de 1.800 cm2 de superficie66. Se recolectó un total de 520 a 580 ml en 150 a 155 inmersiones, lo que resultó en un espesor de muestra promedio de 20 µm. Para las muestras de microcapa superficial, se reservaron 180 ml para incubaciones de microcosmos, y el volumen restante se usó para la extracción de ADN. De todos los transectos, cada muestra reservada para la extracción de ADN se filtró al vacío utilizando filtros de policarbonato de 0,22 µm y luego se almacenó a -80 °C hasta la extracción.

Los gases disueltos también se tomaron muestras in situ en cada transecto para medir las concentraciones disueltas de CO y H2. Los viales de suero (160 ml) se llenaron con agua de mar usando un tubo hermético al gas, permitiendo que se desbordaran aproximadamente 300 ml. A continuación, el vial se selló con un tapón de caucho de butilo de grado de laboratorio tratado, evitando la introducción de gas en el vial. Se introdujo en el vial un espacio de cabeza de N2 ultrapuro (20 ml) extrayendo simultáneamente 20 ml de líquido utilizando dos jeringas herméticas a los gases. A continuación, los viales se agitaron vigorosamente durante 2 minutos antes de equilibrarlos durante 5 minutos para permitir que los gases disueltos entraran en el espacio de cabeza. A continuación, se recogieron 17 ml del espacio de cabeza en una jeringa enjuagada con N2 devolviendo el líquido extraído al vial, y se purgaron 2 ml para enjuagar la llave de paso y la aguja antes de inyectar los 15 ml restantes en un tubo de silicona enjuagado y evacuado con N2. Exetainer67 cerrado para almacenamiento. Los extainers se sellaron con un perno de acero inoxidable y una junta tórica y se almacenaron hasta la medición. Las concentraciones de H2 y CO en los Exetainers se analizaron mediante cromatografía de gases utilizando un detector de ionización de helio de descarga pulsada (modelo TGA-6792-W-4U-2, Valco Instruments), como se describió anteriormente68, calibrado frente a mezclas de gases estándar de CO y H2 de concentraciones conocidas .

Para determinar la capacidad de estas comunidades microbianas marinas para oxidar CO y H2, las muestras de agua de mar se incubaron con estos gases en condiciones de laboratorio y su concentración a lo largo del tiempo se midió mediante cromatografía de gases. Para cada muestra, se configuraron microcosmos por triplicado en los que se transfirió agua de mar a viales de suero envueltos en aluminio (60 ml de agua de mar en viales de 120 ml para Munida transect y Port Phillip Bay; 80 ml de agua de mar en viales de 160 ml para Heron Island) y sellados con suero tratado. tapones de goma de butilo de grado de laboratorio67. Para cada ubicación de muestreo, también se autoclavó un juego de triplicados y se usó como control. El espacio de cabeza del aire ambiente de cada vial se enriqueció con H2 y CO para que alcanzaran proporciones de mezcla de espacio de cabeza inicial de 2 ppmv (transecto de Munida y Port Phillip Bay) o 10 ppmv (Isla Heron). Los microcosmos se agitaron continuamente a 20 °C en una mesa agitadora a 100 rpm. Para las muestras de Munida y Port Phillip Bay, se extrajeron muestras de 1 ml diariamente del espacio de cabeza y su contenido se midió mediante cromatografía de gases como se describe anteriormente. Para las muestras de Heron Island, en cada punto de tiempo, se extrajeron 6 ml de gas y se almacenaron en Exetainers convencionales lavados con UHP-He de 12 ml (2018) o Exetainers sellados con silicona de 3 ml preevacuados67.

Las concentraciones de gases disueltos en agua de mar en estado de equilibrio y a 1 presión atmosférica se calcularon de acuerdo con la relación de Sechenov para soluciones de electrolitos mixtos, como se describe en la ref. 69:

donde kG,0 y kG denotan la solubilidad del gas (o la constante de la ley de Henry en equivalente) en agua y la solución electrolítica mixta, respectivamente, hi es una constante específica para el ion disuelto i (m3 kmol−1), hG es un gas- parámetro específico (m3 kmol−1) y ci representa la concentración del ion i disuelto en solución (kmol m−3). La constante específica del gas, hG, a la temperatura T (en K) sigue la ecuación:

donde hG,0 representa el valor de hG a 298,15 K y hT es un parámetro específico del gas para el efecto de la temperatura (m3 kmol−1 K−1). El parámetro de solubilidad del gas kG,0 a la temperatura T sigue la ley de Henry combinada y la ecuación de van 't Hoff:

donde \(k_{G,0}^\prime\) denota la constante de la ley de Henry del gas a 298,15 K, \({\Delta}_{\mathrm{soln}}H\) es la entalpía de la solución y R es constante de la ley de los gases ideales.

Las concentraciones de gases disueltos en equilibrio con la fase gaseosa del espacio de cabeza a una presión atmosférica y una temperatura de incubación de 20 °C se calcularon sobre la base de una composición media del agua de mar como se indica en la ref. 70. Las constantes de corrección de salinidad hi, hG,0 y hT se adoptaron de la ref. 69, mientras que las constantes de corrección de temperatura \(k_{G,0}^\prime\) y \({\textstyle{{ - {\Delta}_{\mathrm{soln}}H} \over R}}\) se obtuvieron de la ref. 71.

Para el análisis cinético, se usaron puntos de tiempo de medición de hasta 30 días de tiempo de incubación. El patrón de consumo de gas se ajustó con un modelo exponencial y un modelo lineal. El primero mostró un valor de criterio de información de Akaike general más bajo para el consumo de H2 y CO (Tabla complementaria 1). Como tal, las constantes de velocidad de reacción de primer orden se calcularon y utilizaron para el modelo cinético. Además, se consideró que solo las muestras que tenían al menos dos réplicas con una constante de velocidad positiva tenían un consumo seguro de gas. Las tasas de oxidación del gas atmosférico a granel para cada muestra se calcularon con respecto a la relación de mezcla atmosférica media de los gases traza correspondientes (H2: 0,53 ppmv; CO: 0,09 ppmv; CH4: 1,9 ppmv). Para estimar la tasa de oxidación de gas específica de celda, se usaron los valores promedio de conteo directo de celdas informados para las aguas de mar superficiales en el centro de Port Phillip Bay72 y las ocho estaciones a lo largo del transecto Munida65,73. Suponiendo que todas las células son viables y activas, las tasas de oxidación de gases específicas de las células se infirieron luego multiplicando la abundancia relativa estimada de oxidantes de gases traza derivados de las lecturas cortas metagenómicas (el número promedio de copias de genes, suponiendo una copia por organismo; ver 'Metabolic anotación' a continuación) por los recuentos de células para obtener el número de oxidantes de gases traza.

Para estimar las contribuciones energéticas de la oxidación de H2 y CO a los oxidantes de gases traza marinos correspondientes, realizamos un modelo termodinámico para calcular sus respectivos rendimientos energéticos teóricos de acuerdo con la cinética de primer orden de cada muestra estimada anteriormente. Potencia (energía de Gibbs por unidad de tiempo por celda) P sigue la ecuación:

donde v denota la tasa de consumo de sustrato por litro de agua de mar (mol l−1 s−1) y B es el número de células microbianas (células l−1) que realizan las reacciones H2 + 0,5 O2 → H2O (oxidación de dihidrógeno) y CO + 0,5 O2 → CO2 (oxidación de monóxido de carbono). ΔGr representa la energía libre de Gibbs de la reacción en las condiciones experimentales (J mol−1) y sigue la ecuación:

donde \({\Delta}G_{\mathrm{r}}^0\) denota la energía libre de Gibbs estándar de la reacción, Qr denota el cociente de reacción, R representa la constante de los gases ideales y T representa la temperatura en Kelvin. Los valores de \({\Delta}G_{\mathrm{r}}^0\) de la oxidación de hidrógeno y la oxidación de monóxido de carbono se obtuvieron de la ref. 74. Los valores de Qr para cada reacción se calcularon usando:

donde ag y ni denotan la concentración disuelta de la i-ésima especie en agua de mar y el coeficiente estequiométrico de la i-ésima especie en la reacción de interés, respectivamente. Se calcularon las energías libres de Gibbs para la oxidación de hidrógeno y monóxido de carbono a presión atmosférica y temperatura de incubación de 20 °C. Para contextualizar el rendimiento de energía celular a partir de la oxidación de H2 y CO en relación con los requisitos de energía celular informados, se incluye una lista completa de los requisitos de energía de mantenimiento (tasa endógena) y crecimiento (tasa activa) de 121 bacterias organoheterótrofas a 20 °C en la ref. 53 se utilizó como referencia principal. Se derivó una energía de mantenimiento mediana de 1,9 × 10−15 W por célula a partir de las tasas endógenas bacterianas obtenidas en la información de apoyo sd01 de la referencia anterior.

El ADN se extrajo de los filtros de muestra utilizando el kit DNeasy PowerSoil (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas de muestras, incluido un control en blanco de extracción, se prepararon con el kit de preparación de muestras de ADN Nextera XT (Illumina) y se secuenciaron en una plataforma Illumina NextSeq500 (2 × 151 pb) en el Centro Australiano de Ecogenomía (Universidad de Queensland). Se generó un promedio de 20 122 526 pares de lectura por muestra, con 827 868 pares de lectura secuenciados en el control negativo (Tabla complementaria 2). La calidad de los datos metagenómicos sin procesar se controló con la suite BBTools v38.90 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/), usando BBDuk para eliminar la base 151, recortar los adaptadores, filtrar las lecturas de PhiX, recortar el extremo 3' en un umbral de calidad de 15 y descarte de lecturas por debajo de 50 pb de longitud. Las lecturas detectadas en el blanco de extracción se eliminaron adicionalmente con BBMap v38.90, lo que dejó un total del 97,7 % de las lecturas de muestras sin procesar para análisis posteriores. La taxonomía se perfiló a partir de lecturas cortas de alta calidad ensamblando y clasificando los genes 16S rRNA y 18S rRNA con PhyloFlash v3.4 (ref. 75). Las lecturas cortas se ensamblaron individualmente con metaSPAdes v3.14.1 (ref. 76) y colectivamente (todas las muestras juntas y por ubicación) con MEGAHIT v1.2.9 (ref. 77). Los perfiles de cobertura para cada contig se generaron asignando las lecturas cortas a los ensamblajes con BBMap v38.90 (ref. 78).

El agrupamiento del genoma se realizó con MetaBAT2 v2.15.5 (ref. 79), MaxBin 2 v2.2.7 (ref. 80) y CONCOCT v1.1.0 (ref. 81) después de configurar cada herramienta para retener solo contigs ≥2000 pb de longitud. Para cada ensamblaje, los contenedores resultantes se desreplicaron en las herramientas de clasificación con DAS_Tool v1.1.3 (ref. 82). Todos los contenedores se refinaron con RefineM v0.1.2 (ref. 83) y se consolidaron en un conjunto final de genomas ensamblados de metagenomas (MAG) no redundantes con la identidad de nucleótidos promedio predeterminada del 99 % usando dRep v3.2.2 (ref. 84) . La integridad, la contaminación y la heterogeneidad de las cepas de cada MAG se calcularon con CheckM v1.1.3 (ref. 85), lo que dio como resultado un total de 21 de alta calidad (>90 % de integridad, <5 % de contaminación86) y 89 de calidad media (> 50 % de integridad, <10 % de contaminación86) MAG. La taxonomía se asignó a cada MAG con GTDB-Tk v1.6.0 (ref. 87) (utilizando la versión 202 de GTDB)88 y se predijeron marcos de lectura abiertos de cada MAG y, además, en todos los contigs (agrupados y no agrupados) con Prodigal v2.6.3 ( referencia 89). CoverM v0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) 'genoma' se utilizó para calcular la abundancia relativa de cada MAG en cada muestra (–min-read-aligned-percent 0.75,–min-read-percent -identity 0.95,–min-covered-fraction 0) y la cobertura de lectura media por MAG en el conjunto de datos (-m mean,–min-covered-fraction 0).

Para las comparaciones globales, los datos sin procesar del metagenoma (PRJEB1787) y del metatranscriptoma (PRJEB6608) del conjunto de datos global de Tara Oceans se descargaron del Archivo Europeo de Nucleótidos47,50. Además, 1.888 MAG bacterianos y archaeales generados en la ref. Se descargaron 90 (a través de https://www.genoscope.cns.fr/tara/).

Tanto para los metagenomas generados en este estudio como para los del conjunto de datos de Tara Oceans, las lecturas cortas de alta calidad y las proteínas predichas de ensamblajes y MAG se sometieron a anotaciones metabólicas utilizando DIAMOND v2.0.9 (–max-target-seqs 1,–max-hsps 1 )91 para la alineación con un conjunto personalizado de 50 bases de datos de proteínas marcadoras metabólicas. Las proteínas marcadoras (https://doi.org/10.26180/c.5230745) cubren las principales vías de respiración aeróbica y anaeróbica, conservación de energía de compuestos orgánicos e inorgánicos, fijación de carbono, fijación de nitrógeno y fototrofia4. Los aciertos genéticos se filtraron de la siguiente manera: los alineamientos se filtraron para retener solo aquellos de al menos 40 aminoácidos de longitud (150 pb metagenomas del estudio actual), 32 aminoácidos de longitud (100 pb metagenomas y metatranscriptomas de Tara) o con al menos 80 % de consulta o 80 % de cobertura de temas (proteínas previstas de ensamblajes y MAG). Las alineaciones se filtraron aún más por un puntaje de identidad de porcentaje mínimo por proteína: para lecturas cortas, esto fue 80% (PsaA), 75% (HbsT), 70% (PsbA, IsoA, AtpA, YgfK y ARO), 60% (CoxL, MmoA, AmoA, NxrA, RbcL, NuoF, hidrogenasas FeFe e hidrogenasas NiFe Grupo 4) o 50% (todos los demás genes). Para las proteínas predichas, se usaron los mismos umbrales excepto para AtpA (60 %), PsbA (60 %), RdhA (45 %), Cyc2 (35 %) y RHO (30 %).

Para lecturas cortas, la abundancia de genes en la comunidad se estimó como "copias de genes promedio por organismo" dividiendo la abundancia del gen (en lecturas por millón de kilobases, RPKM) por la abundancia media de 14 genes marcadores ribosómicos universales de copia única (en RPKM, obtenido del paquete SingleM v0.13.2, https://github.com/wwood/singlem). Para genes metabólicos de copia única, esto corresponde a la proporción de miembros de la comunidad que codifican el gen. Se utilizó un análisis de correlación lineal, realizado en GraphPad Prism 9, para determinar cómo la abundancia de genes metagenómicos se correlacionaba con las tasas de oxidación de H2 y CO ex situ. Para el conjunto de datos de Tara Oceans, la relación ARN:ADN se calculó dividiendo la abundancia de genes en el metatranscriptoma (en RPKM) por la abundancia de genes en el metagenoma correspondiente (RPKM) para examinar la expresión génica en relación con la abundancia. Cuando estaban presentes metagenomas o metatranscriptomas replicados, los valores de RPKM se promediaron por muestra.

Se construyeron árboles filogenéticos para comprender la distribución y diversidad de microorganismos marinos capaces de oxidar H2 y CO. Se construyeron árboles para las subunidades catalíticas de los grupos 1 y 2 [NiFe]-hidrogenasas, los grupos 3 y 4 [NiFe]-hidrogenasas y la forma I CO deshidrogenasa (CoxL). En todos los casos, las secuencias de proteínas recuperadas de los MAG mediante búsquedas basadas en la homología se alinearon con un subconjunto de secuencias de referencia de bases de datos de proteínas personalizadas6,49 utilizando ClustalW en MEGA11 (ref. 92). En resumen, las relaciones evolutivas se visualizaron mediante la construcción de un árbol filogenético de máxima verosimilitud; específicamente, los árboles iniciales para la búsqueda heurística se obtuvieron automáticamente aplicando los algoritmos Neighbour-Join y BioNJ a una matriz de distancias por pares estimadas usando un modelo Jones-Taylor-Thornton (JTT), y luego seleccionando la topología con valor de verosimilitud superior dentro de MEGA11 . Se usaron todos los residuos y los árboles se reiniciaron con 50 repeticiones. La anotación y visualización del árbol filogenético se realizaron con iTOL (v6.6).

Se generaron modelos de bosque aleatorio, correlaciones de Pearson y correlaciones de Spearman para el conjunto de datos de Tara Oceans para identificar correlaciones significativas entre los metadatos ambientales de muestra y la abundancia normalizada de monóxido de carbono deshidrogenasa, rodopsina y [NiFe] grupos 1d, 1e, 1l, 2a, 3b y 3d genes de hidrogenasa (mostrados como copias por organismo para metagenomas, log10(RPKM + 1) para metatranscriptomas). Para tener en cuenta la colinealidad, donde las variables ambientales estaban altamente correlacionadas (coeficiente de Pearson > |0.7|, figura complementaria 10), se excluyó uno de los modelos de bosque aleatorio para evitar la división de la importancia de las variables entre esas características. Estas variables excluidas se seleccionaron al azar, a menos que estuvieran altamente correlacionadas con la profundidad (que se mantuvo). Luego, usando valores imputados donde faltaban datos (función rfImpute()), se generó un modelo de bosque aleatorio para cada gen anterior usando las variables ambientales marcadas en la Tabla complementaria 6 como predictores (importancia = VERDADERO, ntree = 3,000), usando el R paquete randomForest93. Todas las combinaciones de los genes anteriores y las variables ambientales se correlacionaron adicionalmente con las correlaciones de rango de Pearson y Spearman, omitiendo los valores faltantes y ajustando todos los valores de P con la corrección de la tasa de descubrimiento falso.

En este estudio se analizaron cultivos axénicos de tres cepas bacterianas: Sphingopyxis alaskensis (RB2256)56,57 obtenida de UNSW Sydney, Robiginitalea biformata DSM-15991 (ref. 54) importada de DSMZ y Marinovum algicola FF3 (Rhodobacteraceae)55 importada de DSMZ. Los cultivos se mantuvieron en viales de suero de vidrio de 120 ml que contenían un espacio superior de aire ambiente (proporción de mezcla de H2 ~0,5 ppmv) sellados con tapones de caucho butílico de grado de laboratorio tratados67. Los cultivos de caldo de las tres especies se cultivaron en 30 ml de medio Difco 2216 Marine Broth y se incubaron a 30 °C a una velocidad de agitación de 150 rpm en una incubadora mezcladora orbital Ratek con acceso a ciclos naturales de día/noche. El crecimiento se controló determinando la densidad óptica (DO600) de extractos de 1 ml muestreados periódicamente utilizando un bioespectrofotómetro Eppendorf. La capacidad de los tres cultivos para oxidar H2 se midió por cromatografía de gases. Se abrieron los cultivos por triplicado biológico, se equilibraron con aire ambiente (1 h) y se volvieron a sellar. Estos viales vueltos a airear luego se modificaron con H2 (a través de H2 al 1 % v/v en un cilindro de gas N2, 99,999 % de pureza) para lograr concentraciones finales en el espacio de cabeza de ~10 ppmv. Las proporciones de mezcla del espacio de cabeza se midieron inmediatamente después del cierre ya intervalos regulares hasta que se alcanzó el límite de cuantificación del cromatógrafo de gases (42 ppbv H2). Este análisis se realizó tanto para cultivos en fase exponencial (OD600 0.67 para S. alaskensis) como estacionarios (~72 h post ODmax para S. alaskensis).

Se utilizó PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) para determinar los niveles de expresión del gen de la subunidad grande de [NiFe]-hidrogenasa del grupo 2a (hucL; locus Sala_3198) en S. alaskensis durante el crecimiento y la supervivencia. Para la extracción de ARN, se cultivaron sincrónicamente cultivos de 30 ml de S. alaskensis por triplicado en viales de suero sellados de 120 ml. Los cultivos se cultivaron en fase exponencial (OD600 0,67) o fase estacionaria (48 h después de ODmax ~3,2). A continuación, las células se apagaron con una solución salina de glicerol (-20 °C, 3:2 v/v), se recogieron por centrifugación (20 000 × g, 30 min, -9 °C), se resuspendieron en 1 ml de glicerol 1:1 frío. : solución salina (-20 °C) y centrifugado adicional (20 000 × g, 30 min, -9 °C). Brevemente, los sedimentos de células resultantes se resuspendieron en 1 ml de reactivo TRIzol (Thermo Fisher), se mezclaron con perlas de circón de 0,1 mm (0,3 g) y se sometieron a batido de perlas (tres ciclos de 30 s encendido/30 s apagado, 5000 rpm) en un Precellys 24 homogeneizador (Bertin Technologies) antes de la centrifugación (12 000 × g, 10 min, 4 °C). El ARN total se extrajo mediante el método de fenol-cloroformo siguiendo las instrucciones del fabricante (guía del usuario del reactivo TRIzol, Thermo Fisher) y se resuspendió en agua tratada con dietilpirocarbonato. El ARN se trató con el kit TURBO DNA-free (Thermo Fisher) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la pureza del ARN se confirmaron utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000.

El ADN complementario se sintetizó utilizando un kit SuperScript III First-Strand Synthesis System para RT-qPCR (Thermo Fisher) con cebadores de hexámeros aleatorios, siguiendo las instrucciones del fabricante. La RT-qPCR se realizó en un sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 7 Flex (Applied Biosystems) usando un LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche) en placas de 96 pozos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores se diseñaron utilizando Primer3 (ref. 94) para apuntar al gen hucL (HucL_fw: AGCTACACAAACCCTCGACA; HucL_rvs: AGTCGATCATGAACAGGCCA) y el gen 16S rRNA como gen de mantenimiento (16S_fwd: AACCCTCATCCCTAGTTGCC; 16S_rvs: GGTTAGAGCATTGCCTTCGG). El número de copias de cada gen se interpoló a partir de las curvas estándar de cada gen creadas a partir de los valores del ciclo umbral (CT) de los amplicones que se diluyeron en serie de 108 a 10 copias (R2 > 0,98). Los datos de expresión de hidrogenasa luego se normalizaron al gen de limpieza en fase exponencial. Todas las muestras biológicas por triplicado, los estándares y los controles negativos se procesaron por duplicado técnico. Se utilizó una prueba t de Student en GraphPad Prism 9 para comparar los niveles de expresión de hucL entre las fases exponencial y estacionaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los metagenomas sin procesar y los genomas ensamblados con metagenomas se depositan en el Archivo de lectura de secuencias de NCBI con el número de acceso de BioProject PRJNA801081. Los datos sin procesar del metagenoma (PRJEB1787) y el metatranscriptoma (PRJEB6608) del conjunto de datos global de Tara Oceans se descargaron del Archivo Europeo de Nucleótidos (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB402). MAG bacterianos y arqueales (1.888) generados en la ref. 90 se descargaron de https://www.genoscope.cns.fr/tara/. La base de datos de proteínas marcadoras metabólicas utilizada en este estudio, que incluye secuencias de referencia de hidrogenasa y monóxido de carbono deshidrogenasa, se puede obtener en https://bridges.monash.edu/collections/_/5230745.

Los scripts de análisis de metagenómica están disponibles públicamente en https://github.com/greeninglab/MarineOxidationManuscript.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones del Proyecto ARC Discovery (DP180101762 y DP210101595, ambas otorgadas a PLMC y CG; DP150100244 otorgadas a RC), una beca ARC DECRA (DE170100310; salario para CG), una beca NHMRC EL2 (APP1178715; salario para CG), una beca de estipendio de capacitación en investigación del gobierno australiano (otorgada a PML), becas de matrícula internacional de Monash (otorgadas a PML y Y.-JC) y premios de publicaciones de posgrado de Monash (otorgados a ZFI y Y.-JC).

Estos autores contribuyeron igualmente: Rachael Lappan, Guy Shelley, Zahra F. Islam.

Departamento de Microbiología, Instituto de Descubrimiento de Biomedicina, Universidad de Monash, Melbourne, Victoria, Australia

Rachael Lappan, Zahra F. Islam, Pok Man Leung, Thanavit Jirapanjawat, Gaofeng Ni, Ya-Jou Chen y Chris Greening

Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Monash, Melbourne, Victoria, Australia

Guy Shelley, Ya-Jou Chen y Chris Greening

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Otago, Dunedin, Nueva Zelanda

Scott Lockwood y Sergio E. Morales

Facultad de Química, Universidad de Monash, Melbourne, Victoria, Australia

Philipp A. Nauer y Perran LM Cook

Center to Impact AMR, Universidad de Monash, Melbourne, Victoria, Australia

Thanavit Jirapanjawat y Chris Greening

Escuela de la Tierra, la Atmósfera y el Medio Ambiente, Universidad de Monash, Melbourne, Victoria, Australia

Adán J. Kessler

Facultad de Biotecnología y Ciencias Biomoleculares, UNSW Sídney, Sídney, Nueva Gales del Sur, Australia

Timothy J. Williams y Ricardo Cavicchioli

Oceanografía fúngica y biogeoquímica, Departamento de ecología funcional y evolutiva, Universidad de Viena, Viena, Austria

federico baltar

SAEF: Asegurar el futuro ambiental de la Antártida, Universidad de Monash, Melbourne, Victoria, Australia

Chris Greening

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CG concibió y supervisó este estudio. Experimentos diseñados por CG, GS, SEM, PLMC, RL y ZFI. GS, SL, SEM, PAN, Y.-JC, AJK y PLMC contribuyeron al trabajo de campo. RL, GS, SL y CG contribuyeron al análisis del metagenoma. CG y GN contribuyeron al análisis filogenético. GS, PML, PAN y CG contribuyeron al análisis biogeoquímico. PML, CG, FB y PMLC contribuyeron al modelado termodinámico. ZFI, TJ, GS, TJW, RC y CG contribuyeron al trabajo basado en la cultura. RL y CG contribuyeron al análisis de impulsores ambientales. CG, RL y ZFI escribieron el documento con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Chris Greening.

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

Nature Microbiology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Figs suplementarias. 1–14 y leyendas para las tablas complementarias 1–6.

Libro de trabajo de Excel que contiene las tablas complementarias 1 a 6, la mayoría de las cuales se componen de varias pestañas. El número de tabla se designa en la primera fila de cada hoja de cálculo y también en los nombres de las pestañas.

Datos de origen para la figura 1.

Datos de origen para la figura 2.

Datos de origen para la figura 3.

Datos de origen para la figura 4.

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Lappan, R., Shelley, G., Islam, ZF et al. El hidrógeno molecular en el agua de mar favorece el crecimiento de diversas bacterias marinas. Nat Microbiol 8, 581–595 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01322-0

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Recibido: 26 Agosto 2022

Aceptado: 05 enero 2023

Publicado: 06 febrero 2023

Fecha de emisión: abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01322-0

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