Efectos de la acidificación sobre la nitrificación y la emisión de óxido nitroso asociada en aguas estuarinas y costeras

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1380 (2023) Citar este artículo

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En el contexto de un nivel de dióxido de carbono (CO2) atmosférico en aumento, la acidificación de las aguas estuarinas y costeras se ve muy exacerbada por los aportes de nutrientes derivados de la tierra, el afloramiento costero y los procesos biogeoquímicos complejos. Una comprensión más profunda de cómo responden los nitrificantes a la intensificación de la acidificación es crucial para predecir la respuesta de los ecosistemas estuarinos y costeros y su contribución al cambio climático global. Aquí, mostramos que la acidificación puede disminuir significativamente la tasa de nitrificación pero estimular la generación de óxido nitroso (N2O) como subproducto en aguas costeras y estuarinas. Al variar la concentración de CO2 y el pH de forma independiente, se excluye un efecto beneficioso esperado del CO2 elevado sobre la actividad de los nitrificantes (efecto de "fertilización con CO2") bajo la acidificación. Los datos del metatranscriptoma demuestran además que los nitrificantes podrían regular significativamente las expresiones génicas asociadas con la homeostasis del pH intracelular para hacer frente al estrés por acidificación. Este estudio destaca los fundamentos moleculares de los efectos de la acidificación en la nitrificación y la emisión asociada de gases de efecto invernadero, N2O, y ayuda a predecir la respuesta y evolución de los ecosistemas estuarinos y costeros bajo el cambio climático y las actividades humanas.

El dióxido de carbono (CO2) en la atmósfera ha ido en aumento debido a las actividades humanas intensivas, como la combustión de combustibles fósiles, la producción de cemento, la deforestación y otros cambios en el uso de la tierra1. A nivel mundial, la concentración atmosférica promedio de CO2 ahora ha alcanzado 413,2 ppm y se espera que supere las 800 ppm para fines del siglo XXI2,3. Aproximadamente el 40 % del CO2 emitido durante la era industrial ha sido absorbido por los océanos4, lo que ha provocado una reducción de alrededor de 0,1 unidades de pH en el agua de mar superficial5,6. Se estima una disminución adicional de 0,2–0,3 unidades de pH a finales de este siglo, con graves consecuencias previstas para los organismos y ecosistemas sensibles6,7,8.

Los ecosistemas estuarinos y costeros son regiones dinámicas bajo la interacción de los ríos, la tierra y los océanos9, que pueden proporcionar servicios ecosistémicos vitales para el bienestar humano10. Sin embargo, en el contexto de un nivel de CO2 atmosférico en aumento, las aguas costeras y de estuarios sufren una acidificación más aguda que los océanos abiertos, debido a los efectos sinérgicos de los aportes de nutrientes derivados de la tierra, el afloramiento costero y los procesos biogeoquímicos complejos (Fig. 1 complementaria) 11,12. Una de las mayores amenazas para los ecosistemas estuarinos y costeros en todo el mundo es el aporte excesivo de nutrientes antropogénicos de las cuencas hidrográficas10. La producción de fitoplancton inducida por la eutrofización puede resultar en una alta tasa de respiración en las aguas del fondo donde se asienta la materia derivada de las algas, lo que puede causar una fuerte producción de CO213. La acidificación en las aguas estuarinas y costeras puede, por lo tanto, verse muy intensificada por la intrusión episódica de agua de afloramiento con alto contenido de CO211,13,14, que puede afectar negativamente los procesos biológicos y el funcionamiento de los ecosistemas estuarinos y costeros15,16,17,18,19,20,21 .

La nitrificación es un proceso crítico para el equilibrio de las reservas de nitrógeno reducido y oxidado, que vincula la mineralización con las vías de eliminación de nitrógeno de la desnitrificación y la oxidación anaeróbica del amonio22. Por lo tanto, juega un papel crucial en el ciclo global del nitrógeno, especialmente en los ecosistemas acuáticos eutróficos. Debido al lento crecimiento de los nitrificantes y su alta sensibilidad a las perturbaciones ambientales23, se prevé que la acidificación acuática perturbe la nitrificación. Una complicación en la respuesta de los nitrificantes a la acidificación es que el aumento de la presión parcial de CO2 (pCO2) y la disminución del pH pueden tener efectos opuestos. Se espera que una condición de pCO2 más alta beneficie la nitrificación, ya que una mayor fuente de carbono puede promover el crecimiento de nitrificantes quimioautotróficos (fertilización con CO2)24,25,26,27. Por el contrario, la disminución concomitante del pH puede cambiar el equilibrio entre el amoníaco (NH3) y el amonio (NH4+) hacia una menor concentración de sustrato NH3 disponible para los oxidantes de amoníaco y, por lo tanto, inhibir la nitrificación25,28,29. Por tanto, la respuesta de los nitrificantes depende en gran medida del equilibrio de estos posibles efectos positivos y negativos. Sin embargo, se sabe poco sobre los efectos de los niveles proyectados de acidificación acuática en el metabolismo de los nitrificantes y los mecanismos subyacentes.

La nitrificación también es una vía importante para la producción de óxido nitroso (N2O)30,31,32,33, un gas de efecto invernadero, que tiene un forzamiento radiativo por mol >300 veces más fuerte que el CO2 y puede reaccionar con el ozono en la estratosfera34. El N2O puede ser producido enzimáticamente por bacterias oxidantes de amoníaco (AOB) a través de la conversión de hidroxilamina (NH2OH) a N2O35,36, o a través de la desnitrificación con nitrificador [una reducción secuencial de nitrito (NO2−) a óxido nítrico (NO) y N2O]35. Recientemente, también se caracterizó la conversión biótica de NH2OH a N2O por AOB a través del citocromo P46036. Por el contrario, se cree que la emisión de N2O asociada con la oxidación de NH3 por arqueas oxidantes de amoníaco (AOA) se debe principalmente a reacciones abióticas entre NH2OH y NO2− o NO32,37,38. Estudios previos sugirieron que AOA produce rendimientos más bajos de N2O que AOB durante la oxidación aeróbica de NH337,39. Además, se ha documentado que los oxidantes de amoníaco completos (comammox) exhiben un rendimiento de N2O más bajo que AOB, ya que el N2O se origina más bien a partir de la conversión abiótica de NH2OH por bacterias comammox40,41. Sin embargo, aún no está claro cómo responderá la producción de N2O nitrificante a la acidificación acuática.

Aquí examinamos cómo la acidificación acuática afecta la tasa de nitrificación y la emisión de N2O asociada en el estuario del Yangtze y las aguas costeras adyacentes. También se realizan experimentos de manipulación para desacoplar los efectos individuales de una pCO2 elevada y un pH reducido. Los metatranscriptomas se analizan más a fondo para dilucidar la respuesta metabólica de los microbios nitrificantes mediante el seguimiento de la expresión de genes sensibles a la acidificación. Esta investigación proporciona información sobre las interacciones mecánicas entre la acidificación y la nitrificación, y ayuda a predecir la futura evolución ecológica de los ecosistemas estuarinos y costeros.

Se lograron diferentes niveles de acidificación (pH reducido en 0,10–1,05) a través de muestras de agua burbujeante recolectadas de seis sitios representativos (Yz1–Yz6) a lo largo del estuario del Yangtze y las aguas costeras adyacentes con diferentes mezclas de gas aire:CO2 (Fig. 1, Tablas complementarias 1 y 2). Las tasas de nitrificación en estos sitios mostraron una respuesta idéntica a la acidificación: todos disminuyeron notablemente cuando se redujo el pH, independientemente de un posible efecto beneficioso de CO2 alto (Figura 2 complementaria). Se detectó una disminución en las tasas de nitrificación (5,8–18,1 %) con la reducción del pH, incluso de 7,92–8,15 a 7,80–8,04 (pCO2 aumentó en 122–172 μatm) (P < 0,05). Las tasas de nitrificación disminuyeron entre ~11,1 y 34,1 % cuando se duplicó la pCO2 (P < 0,05). La disminución de las tasas de nitrificación se correlacionó fuertemente con la reducción del pH del agua (P < 0.05), según las curvas de respuesta a la acidificación construidas (Fig. 2a). Las tasas de nitrificación disminuirían entre ~7,7% y 25,0% con una reducción promedio de alrededor de 0,21 unidades de pH que se ha observado en aguas costeras y de estuarios en todo el mundo durante las últimas décadas (Fig. 1 complementaria). Este efecto de inhibición de la acidificación sobre la tasa de nitrificación es consistente con lo que se observó previamente en los océanos abiertos28,42. Si bien se informó que la tasa de nitrificación aumentó a lo largo de un gradiente natural decreciente de pH en Narragansett Bay43, probablemente se debió a una combinación de condiciones biogeoquímicas más que al efecto de la acidificación únicamente.

Las estaciones están marcadas con estrellas rojas.

a Tasas de nitrificación. Los datos muestran los cambios porcentuales de las tasas de nitrificación en los tratamientos acidificados en comparación con el control ambiental. Para todas las líneas, P < 0,05. b Tasas de producción de N2O. Los datos muestran los cambios porcentuales de las tasas de producción de N2O en los tratamientos acidificados en comparación con el control ambiental. Para todas las líneas, P < 0,05. Las barras de error representan SD (n = 3 muestras biológicamente independientes). ΔpH corresponde a la disminución entre el pH del agua antes y después de la acidificación. La curva de ajuste se obtuvo mediante el método de ajuste polinomial. Las ecuaciones y los valores de P para las curvas ajustadas se proporcionan en la Tabla complementaria 3. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La inhibición de la tasa de nitrificación por acidificación tendió a ser menor en las aguas del estuario superior donde los AOB eran los oxidantes de amoníaco dominantes que en las regiones costeras adyacentes donde las comunidades oxidantes de amoníaco estaban dominadas por AOA (Fig. 2a y Suplementario Fig. 3) . Además de la heterogeneidad de las comunidades microbianas nitrificantes, esta variabilidad en la influencia de la acidificación en la tasa de nitrificación puede deberse a múltiples factores biogeoquímicos43. Especialmente, las concentraciones de NH4+ relativamente más altas en los estuarios superiores pueden mitigar los efectos inhibidores de la oxidación del amoníaco causados ​​por la acidificación (Tabla complementaria 1). Consistentemente, la inhibición medida de la tasa de nitrificación por acidificación en las aguas estuarinas y costeras fue generalmente más baja que en los mares oligotróficos donde se informó que las tasas de nitrificación disminuyeron entre un 3% y un 44% en respuesta a una disminución de 0,1 unidades de pH28,42. De hecho, la concentración de NH4+ se correlacionó negativamente con el efecto de inhibición de la acidificación sobre la tasa de nitrificación en diferentes hábitats que van desde estuarios hasta mar abierto (P < 0,05)28,42,44 (Figura complementaria 4). Sin embargo, considerando el agravamiento más rápido y continuo de la acidificación en las aguas estuarinas y costeras debido a los efectos sinérgicos de la eutrofización inducida por la actividad humana y el nivel elevado de CO2 atmosférico11, su alteración en las tasas de nitrificación podría tener profundas consecuencias en los procesos de los ecosistemas estuarinos y costeros.

Basado en la respuesta de las tasas de nitrificación, ref. 28 especuló que la disminución de las tasas de nitrificación como resultado de la acidificación del océano podría reducir en gran medida la producción de N2O en el océano abierto. Sin embargo, el impacto de la acidificación acuática en la producción de N2O puede desvincularse de su impacto en las tasas de nitrificación45. Por ejemplo, ref. 42 informaron recientemente que cuando se redujo el pH del agua de mar en el Pacífico Norte occidental, la producción de N2O aumentó significativamente mientras que las tasas de nitrificación permanecieron estables o incluso disminuyeron. Sin embargo, en su trabajo, la acidificación fue manipulada agregando ácido fuerte (HCl). Aunque la adición de HCl puede elevar la pCO2 y reducir el pH, también altera la alcalinidad y da como resultado parámetros de carbonato diferentes en comparación con los esperados en el futuro, es decir, el carbono inorgánico disuelto (DIC) aumenta con la acidificación acuática natural en lugar de permanecer sin cambios46. Además, las comunidades nitrificantes en diversos hábitats acuáticos pueden responder de manera diferente a la acidificación, ya que los mecanismos para la producción de N2O difieren entre los diferentes organismos nitrificantes32,38,40. Por lo tanto, es necesario evaluar la respuesta de la producción de N2O durante la nitrificación a la acidificación acuática en aguas estuarinas y costeras.

A través de la aireación con aire estéril a diferentes niveles de CO247, que puede imitar mejor la acidificación acuática en curso, descubrimos que las tasas de producción de N2O en todos los sitios de muestreo aumentaron significativamente por la acidificación (Figura 5 complementaria). Incluso con una disminución del pH de ~0,1 unidades (7,92–8,15 a 7,80–8,04), se observó una promoción significativa de la producción de N2O (8,4–23,1 %) al final de la incubación (P < 0,05). Se construyeron curvas de acidificación-respuesta entre la disminución del pH y la emisión de N2O, mostrando un aumento significativo de las tasas de producción de N2O junto con el aumento de los niveles de acidificación (P < 0,05) (Fig. 2b). Bajo una reducción promedio de aproximadamente 0,21 unidades de pH detectada en las regiones estuarinas y costeras de todo el mundo, las tasas de producción de N2O durante la nitrificación podrían aumentar entre ~9,5 y 27,5 % (Fig. 2b). Estos hallazgos respaldan nuestra hipótesis de que, al igual que otras perturbaciones ambientales, como la exposición a sustancias tóxicas y al oxígeno bajo23,42,48, la acidificación puede aumentar la producción de N2O en aguas costeras y de estuarios, independientemente de si dominan AOB o AOA. Por lo tanto, aunque los mecanismos para la producción de N2O difieren entre los diferentes organismos nitrificantes32,38,40, su tasa de producción de N2O podría aumentar con la reducción del pH. El aumento de la producción de N2O en condiciones acidificadas en aguas estuarinas y costeras es coherente con el del Pacífico Norte occidental42. Sin embargo, ref. 44 inhibición documentada de la producción de N2O por la acidificación del océano en aguas de mar frías templadas y polares. Suponiendo que la nitrificación es la principal vía de producción de N2O en su estudio, la respuesta de la producción de N2O a la acidificación sería diferente en los mares polares. Aunque los desnitrificadores heterótrofos también pueden contribuir a la producción de N2O, su contribución puede ser insignificante, ya que las firmas isotópicas naturales de N2O mostraron que la vía de reducción de NO2− (incluida la desnitrificación con nitrificador y la desnitrificación heterótrofa) contribuyó solo entre el 0 y el 13,3 % de la liberación. N2O (Tabla complementaria 4). Además, las muestras de todos los sitios de estudio estaban bien oxigenadas [oxígeno disuelto (OD): 8,30–9,86 mg L−1; Tabla complementaria 1] y permaneció en niveles altos de DO durante la incubación (Tabla complementaria 2), lo que era poco probable que ocurriera para la desnitrificación heterótrofa. Estudios previos informaron que cuando la concentración de OD es superior a 0,06 mg L−1, la producción de N2O por desnitrificación heterótrofa se inhibe por completo49. Por lo tanto, la contribución de las bacterias desnitrificantes a la producción de N2O debería ser insignificante. Este estudio demuestra que la producción de N2O durante la nitrificación de los nitrificantes dominados por AOB y AOA puede ser estimulada por la acidificación, que es un paso importante para evaluar el impacto de la acidificación en curso en la emisión de N2O en los complejos y dinámicos ecosistemas estuarinos y costeros. Si nuestros resultados fueran representativos y los nitrificantes contribuyeran a la mitad de las emisiones globales de N2O en estuarios y costas50,51 (Figura 6 complementaria y Tabla complementaria 5), ​​las emisiones de N2O derivadas de la nitrificación en estos ecosistemas aumentarían entre 0,05 y 0,15 Tg N2O-N año −1 en respuesta a una disminución promedio de 0,21 unidades de pH (Texto complementario 1), lo que representa entre el 0,7 y el 2,2 % de las emisiones antropógenas totales de N2O a nivel mundial (6,9 Tg N2O-N año−1)52.

Nuestros resultados mostraron que la acidificación puede inhibir las tasas de nitrificación pero aumentar las emisiones de N2O en aguas costeras y estuarinas (Fig. 2). Sin embargo, el aumento de la pCO2 y la disminución del pH pueden tener efectos opuestos sobre los nitrificantes. Para distinguir los efectos individuales de una pCO2 elevada y un pH reducido, se construyeron una serie de sistemas de microcosmos abiertos de flujo continuo. La química del carbonato se manipuló burbujeando constantemente muestras de agua recolectadas del sitio Yz3 con aire ajustado con CO2 (400 μatm y 800 μatm) mientras se ajustaba el pH (7.8 y 8.1) con una solución estéril de ácido o base de acuerdo con un detector de pH en tiempo real (Fig. 7). Los estados de equilibrio se lograron en cuatro escenarios [pCO2 bajo (400 μatm) y pH alto (8.1); baja pCO2 (400 μatm) y bajo pH (7,8); pCO2 alto (800 μatm) y pH bajo (7,8); pCO2 alto (800 μatm) y pH alto (8.1)] y se mantuvo estable durante el período de incubación (Tabla complementaria 6). Los resultados mostraron que las tasas de nitrificación disminuyeron significativamente a pH bajo, independientemente del nivel de pCO2 (Fig. 3a), lo que demuestra los efectos negativos del pH reducido en las tasas de nitrificación. Sin embargo, el efecto de una pCO2 elevada, que se espera beneficie la nitrificación, parece depender del pH (Fig. 3a). Cuando el pH se mantuvo en el ambiente de 8,1, se observó un efecto obvio de "fertilización con CO2" a medida que aumentaban las tasas de nitrificación a una pCO2 alta (Fig. 3a). Por el contrario, en condiciones acidificadas (pH 7,8), la pCO2 elevada provocó una disminución inesperada en las tasas de nitrificación (Fig. 3a). Este patrón sugiere que, cuando los procesos metabólicos de los nitrificantes relacionados se ven afectados por un pH reducido, el aumento de pCO2 se convierte en un factor estresante aditivo. Estos resultados contrastan con la observación de las cianobacterias fijadoras de N2, que pueden beneficiarse de una pCO2 alta en condiciones de pH reducido53.

a Tasas de nitrificación. b Tasas de producción de N2O durante la nitrificación. Se construyeron cuatro escenarios: el control ambiental (400 μatm/pH 8,1, barras sólidas azules), el grupo acidificado (800 μatm/pH 7,8, barras sólidas rojas), reducción de pH solamente (400 μatm/pH 7,8, barras abiertas rojas) , y aumento de pCO2 únicamente (800 μatm/pH 8,1, barras abiertas azules). Las letras minúsculas diferentes (a, b, c y d) sobre las columnas indican diferencias significativas entre los cuatro escenarios (P < 0,05). Las barras de error representan SD (n = 3 muestras biológicamente independientes) y los puntos son los puntos de datos correspondientes de las réplicas. Las diferencias significativas se determinaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La producción de N2O durante la nitrificación fue promovida en condiciones acidificadas (Fig. 2b), tanto por el pH reducido como por la pCO2 elevada (Fig. 3b). La promoción de la producción de N2O bajo una pCO2 alta mientras se mantiene el pH ambiental fue inesperada (Fig. 3b) ya que esta condición era beneficiosa para los nitrificantes (fertilización con CO2; Fig. 3a). Es posible que la producción de N2O como subproducto aumente junto con el aumento de las tasas de nitrificación. Sin embargo, esta posibilidad no puede explicar completamente la emisión mejorada de N2O bajo la condición de elevación única de pCO2 (pCO2 800 μatm/pH 8.1), ya que la promoción de la tasa de producción de N2O fue significativamente mayor que la tasa de nitrificación (Fig. 3). En condiciones acidificadas naturales (una elevación de la pCO2 concomitante con la reducción del pH), puede esperarse la mayor promoción de la emisión de N2O cuando se combinan los efectos de la reducción del pH y la elevación de la pCO2 (Fig. 3b). Este es el primer intento de desvincular los efectos individuales de una pCO2 elevada y un pH reducido en la tasa de nitrificación y la emisión de N2O asociada en ambientes acuáticos acidificados, proporcionando información sobre el mecanismo subyacente de la acidificación acuática que afecta a los nitrificantes. Sus efectos individuales se distinguieron con éxito en función de nuestros sistemas de incubación de pH automático y de flujo de aire continuo construidos. Anteriormente se especuló que el aumento de los niveles de pCO2 podría tener un efecto positivo en la actividad de los nitrificadores quimioautotróficos54. Por el contrario, en condiciones acidificadas, la pCO2 elevada puede inhibir aún más la tasa de nitrificación y promover la emisión de N2O como subproducto no deseado. Por lo tanto, los efectos negativos de la acidificación acuática en las transformaciones de nitrógeno microbiano y su retroalimentación al cambio climático global son probablemente más intensos de lo que se pensaba anteriormente (Fig. 8 complementaria).

Como una respuesta molecular importante al estrés por acidificación, los nitrificantes pueden ajustar las expresiones génicas mediante redes de señalización intracelular55, lo que puede reflejarse aún más en la reducción de la tasa de nitrificación y el aumento de la producción de N2O. Sin embargo, la respuesta transcripcional de las comunidades nitrificantes a la acidificación acuática sigue siendo desconocida. La secuenciación del metatranscriptoma se puede utilizar para interrogar la expresión diferencial de los genes implicados en el metabolismo fisiológico de las comunidades nitrificantes en condiciones acidificadas23. Sin embargo, los intentos anteriores de adquirir metatranscriptomas basados ​​en experimentos de acidificación a corto plazo fallaron porque no había suficiente ARNm con buena integridad y pureza, lo que podría deberse a la extrema inestabilidad del ARNm y la complejidad de las muestras ambientales23. Más importante aún, los nitrificantes representan solo una pequeña fracción de las comunidades microbianas complejas en las aguas estuarinas y costeras (<5%; Fig. 9 complementaria), por lo que es difícil extraer suficientes transcripciones nitrificantes para revelar completamente el metabolismo fisiológico de los nitrificantes. Por lo tanto, se instaló una serie de simuladores ambientales de flujo continuo con muestras de agua del sitio Yz3 para imitar la acidificación a largo plazo y enriquecer los nitrificantes. El pH y la pCO2 en los controles ambientales se mantuvieron en aproximadamente 8,1 y 400 μatm, respectivamente, mientras que se estabilizaron en aproximadamente 7,8 y 800 μatm, respectivamente, en los tratamientos acidificados. Después de ~25 días, los simuladores de funcionamiento continuo exhibieron reacciones de nitrificación estables (Figura complementaria 10) y dominio de las comunidades nitrificantes (que representan el 44,6 % y el 45,5 % en los controles ambientales y los tratamientos acidificados, respectivamente) (Figuras complementarias 11, 12) . Las bacterias nitrificantes in situ se enriquecieron simultáneamente y los miembros originales en el medio ambiente (Nitrosomonas y Nitrospira) siguieron siendo dominantes. Sin embargo, el número de células de AOA no aumentó mucho en los enriquecimientos nitrificantes y, por lo tanto, el cultivo de AOA se llevó a cabo adicionalmente con estreptomicina para inhibir las bacterias nitrificantes. Después de 50 días de incubación, la abundancia relativa de AOA aumentó del 1,1 % al 11,2 %, mientras que las bacterias nitrificantes eran indetectables (Fig. 13 complementaria). Para estos cultivos de enriquecimiento nitrificante, se observaron tasas de nitrificación significativamente reducidas y emisiones estimuladas de N2O en los tratamientos acidificados (Figuras complementarias 14, 15), un patrón consistente con el de las muestras de agua de campo. Aunque la manipulación del enriquecimiento cambia las comunidades microbianas ambientales originales, los enriquecimientos nitrificantes son representativos para investigar la respuesta transcripcional de los nitrificantes a la acidificación en aguas costeras y estuarinas complejas.

De acuerdo con los análisis metatranscriptómicos (Tabla complementaria 7), la acidificación inducida por CO2 puede afectar significativamente los metabolismos fisiológicos de los nitrificadores a nivel transcripcional, ya que los genes involucrados en las transformaciones de nitrógeno, la homeostasis del pH citosólico, la generación de energía y la fijación de CO2 fueron todos regulados en gran medida por acidificación (Figs. 4a–c, 5a–c). La expresión de la subunidad potencialmente activa del gen de la monooxigenasa de amoníaco (amoA) de AOB se reguló a la baja en un 66% para los tratamientos acidificados (Fig. 4a). La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR) también demostró que la expresión del gen bacteriano amoA se reguló significativamente a la baja en condiciones acidificadas (P <0.01; Tabla complementaria 9). Consistentemente, las expresiones de amoB bacteriano (subunidad B de amoníaco monooxigenasa, también sugerida como una subunidad catalítica56) y amoC (subunidad C de amoníaco monooxigenasa) disminuyeron en un 68 y 69%, respectivamente, después de la acidificación (Fig. 4c). Además, la expresión del gen de la hidroxilamina deshidrogenasa (hao) se reguló a la baja en un 61 % (P < 0,01), mientras que la expresión de los genes de la nitrito oxidorreductasa nxrA y nxrB se redujo en un 76 y un 61 % (P < 0,01), respectivamente, bajo condiciones acidificadas (Fig. 4c y Tabla complementaria 9). Según los datos transcripcionales de AOA, la expresión de archaeal amoA también se reguló a la baja (24%) en condiciones acidificadas (P <0.05) (Fig. 5a y Tabla complementaria 9). Además, las transcripciones de archaeal amoC se regularon a la baja en un 43%, mientras que la expresión de archaeal amoB permaneció sin cambios bajo acidificación (Fig. 5c). En general, las transcripciones de genes funcionales involucradas en la oxidación gradual de NH3 a nitrato (NO3-) generalmente se regularon a la baja en condiciones acidificadas, de acuerdo con la reducción de las tasas de nitrificación (Fig. 2a).

un modelo esquemático que representa los efectos de la acidificación en la expresión de genes implicados en la oxidación gradual de NH3 (NH3 → NH2OH → NO → NO2− → NO3−), producción de N2O, generación de energía y homeostasis del pH citosólico de bacterias nitrificantes. La membrana está rota por la línea de puntos, ya que la oxidación de nitritos no ocurre a menudo en el mismo organismo con la oxidación de amoníaco, con la excepción de Nitrospira comammox descubierta recientemente. Se calculó el cambio de veces (FC) en la expresión génica relativa comparando las muestras acidificadas con el control ambiental. Los números romanos se refieren al complejo enzimático I (NADH deshidrogenasa), complejo III (complejo de citocromo bc1), complejo IV (citocromo c oxidasa) y complejo V (ATP sintasa) en la cadena respiratoria. Las flechas azules punteadas muestran el movimiento de los electrones. E, enzima desconocida. b Efectos de la acidificación en la expresión de genes implicados en la fijación de CO2 a través de los ciclos de Calvin y del ácido tricarboxílico reductor (rTCA). Los colores en el centro de los pictogramas de proteínas indican el grado de regulación hacia arriba o hacia abajo de las transcripciones de genes que codifican estas proteínas. Los colores en la periferia de los pictogramas de proteínas corresponden a los colores de las barras en (c). c FC de transcritos que codifican proteínas mostradas en (a) y (b). Las definiciones de las abreviaturas se muestran en la Tabla complementaria 8. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

un modelo esquemático que representa los efectos de la acidificación en la expresión de genes implicados en la oxidación de NH3, la producción de N2O, la generación de energía y la homeostasis del pH citosólico de AOA. Se calculó el cambio de veces (FC) en la expresión génica relativa comparando las muestras acidificadas con el control ambiental. Los números romanos se refieren al complejo enzimático I (NADH deshidrogenasa), complejo III (b-pcy), complejo IV (pcy-aa3) y complejo V (ATP sintasa) en la cadena respiratoria. Las flechas azules punteadas muestran el movimiento de los electrones. b Efectos de la acidificación sobre la expresión de genes implicados en el ciclo 3-hidroxipropionato/4-hidroxibutirato. Los colores en el centro de los pictogramas de proteínas indican el grado de regulación hacia arriba o hacia abajo de las transcripciones de genes que codifican estas proteínas. Los colores en la periferia de los pictogramas de proteínas corresponden a los colores de las barras en (c). c FC de transcritos que codifican proteínas mostradas en (a) y (b). Las definiciones de las abreviaturas se muestran en la Tabla complementaria 8. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Por el contrario, las transcripciones de los genes que codifican la óxido nítrico reductasa bacteriana nitrificante (formadora de N2O, nor) se regularon por acidificación (Fig. 4a). Las expresiones de los genes norB, norC, norD y norQ de AOB se regularon al alza en 2.5, 16.2, 0.7 y 0.2 veces, respectivamente (Fig. 4c y Tabla complementaria 9). Estos resultados proporcionan evidencia molecular de la estimulación observada de la emisión de N2O en condiciones acidificadas. Aunque las enzimas alternativas también podrían haber contribuido a las emisiones de N2O bacteriano nitrificante, como el citocromo c554 (codificado por cycA)57, el citocromo c'-β (codificado por cytS)58 y el citocromo P46036, no se observaron transcripciones de estas proteínas en este estudio. . En contraste con la expresión dramáticamente regulada al alza de los genes de la óxido nítrico reductasa, las transcripciones de la nitrito reductasa (que forma NO, nirK) de las bacterias nitrificantes estaban reguladas a la baja en un 43 % en los tratamientos acidificados en comparación con el control ambiental (P < 0,05) (Fig. 4c y Tabla complementaria 9), lo que implica que la acidificación podría haber inhibido la reducción de NO2- por parte de las bacterias nitrificantes. Por lo tanto, la emisión mejorada de N2O en condiciones acidificadas no procedía de la ruta de desnitrificación de los nitrificantes bacterianos. Aunque se sugirió que la reacción híbrida abiótica era la fuente principal del rendimiento de N2O de las arqueas32,37,38, se especuló que las enzimas presuntas, incluidas la hidroxilamina oxidorreductasa de cobre (Cu-HAO) y la nitroxil oxidorreductasa putativa, estaban involucradas en la producción de N2O de AOA59. Sin embargo, no se observaron transcripciones de estas presuntas proteínas (Fig. 5a). Además, la nitrito reductasa de cobre arqueal (nirK) puede funcionar como HAO similar a una bacteria para oxidar NH2OH a N2O, o puede estar involucrada en la producción de N2O de AOA a través de la desnitrificación con nitrificador59. Sin embargo, la respuesta transcripcional del gen archaeal nirK puede no ser la causa principal del aumento de la emisión de N2O bajo acidificación, ya que la expresión de archaeal nirK se reguló ligeramente a la baja (Fig. 5c). Por el contrario, las transcripciones del presunto gen norQ de la óxido nítrico reductasa arqueal estaban reguladas al alza en 0,2 veces en condiciones acidificadas (Fig. 5c). Mientras que, debido a la comprensión limitada de las vías de producción de N2O impulsadas por AOA, el mecanismo molecular de la elevación de la emisión de N2O mediada por AOA bajo acidificación debe aclararse más.

Se informó que el pH intracelular de la cianobacteria disminuye junto con el pH del agua en condiciones acidificadas53. Si el caso sucede con los nitrificantes, es posible que necesiten generar más fuerza motriz de protones (PMF), que se requiere para la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP)60. Sin embargo, las transcripciones de genes involucradas en las enzimas unidas a la membrana que translocan protones de las bacterias nitrificantes enriquecidas se regularon a la baja en los tratamientos acidificados (Log2FC <-1) (Fig. 4a). Los transcritos bacterianos nitrificantes del gen de NADH-quinona oxidorreductasa (nuo) del complejo I, el gen de ubiquinol-citocromo c reductasa (pet) del complejo III y el gen de citocromo c oxidasa del complejo IV se redujeron en un 60%, 57% y 61 %, respectivamente, en condiciones acidificadas (Fig. 4c). Por lo tanto, con base en estos datos, no podemos distinguir si el pH citoplasmático de las bacterias nitrificantes se redujo bajo el grado de acidificación impuesto. Sin embargo, se obtuvo una información importante al investigar las transcripciones de los genes que codifican las trifosfatasas de adenosina (ATPasas) productoras de energía. La familia de ATPasas bacterianas comprende complejos proteicos unidos a la membrana responsables de la síntesis de ATP utilizando un PMF de membrana cruzada o del establecimiento de PMF utilizando la energía liberada de la hidrólisis de ATP61,62. Según los datos metatranscriptómicos, las transcripciones de los genes que codifican las ATPasas bacterianas de tipo V, que funcionan como bombas de protones dependientes de ATP, se regularon al alza (hasta un aumento de 11,5 veces) en condiciones acidificadas (Fig. 4c). Este resultado sugiere una necesidad creciente de bacterias nitrificantes para bombear protones citoplasmáticos para mantener la homeostasis del pH y el gradiente de H+ bajo una reducción de ~0,3 unidades de pH. De manera similar, las transcripciones del gen archaeal nuo del complejo I, el gen cox de la citocromo c oxidasa del complejo IV y los genes atp de la ATPasa de tipo V archaeal se regularon significativamente (Log2FC> 0.5; Fig. 5a), lo que muestra que el pH intracelular del El AOA también puede haber disminuido con el pH del agua.

En condiciones acidificadas, podría ocurrir una demanda de energía creciente para la translocación de sustratos a través de las membranas, porque las transcripciones de genes que codifican los transportadores de casete de unión a ATP correspondientes estaban reguladas al alza (con un máximo de regulación al alza de 11 veces, Figs. 4c y 5c). Estos resultados sugieren que una mayor parte de la energía derivada de la oxidación de NH3 o NO2- puede haberse asignado para hacer frente al estrés por acidificación, como para mantener la homeostasis del pH citosólico y los transportes de sustrato. Sin embargo, la producción total de ATP probablemente se redujo, ya que las tasas de nitrificación fueron significativamente inhibidas por la acidificación. Además, las transcripciones de genes que codifican ATPasas bacterianas de tipo F, que funcionan como ATP sintasas impulsadas por PMF, se regularon a la baja por acidificación (con una reducción promedio del 63%, Fig. 4c). Sin embargo, la expresión de genes asociados con el mecanismo de concentración de carbono que satura la enzima carboxilante, ribulosa bisfosfato carboxilasa oxidasa (Rubisco), se reguló a la baja en condiciones acidificadas (Log2FC < -1; Fig. 4a), lo que sugiere un requerimiento energético reducido para el enriquecimiento de CO263 (Texto complementario 2). Este mecanismo de regulación puede explicar el efecto de "fertilización con CO2" observado bajo una pCO2 alta pero bajo un nivel de pH ambiental (800 μatm/pH 8.1) (Fig. 3a), ya que probablemente se ahorró más energía y se reasignó a otros procesos celulares. Sin embargo, la energía ahorrada debido a la fuente elevada de carbono parecía ser menor en comparación con las perturbaciones causadas por la acidificación, ya que se observaron efectos significativamente negativos en condiciones acidificadas (800 μatm/pH 7,8) (Fig. 3a). En conjunto, estos resultados sugieren que la acidificación puede conducir a una menor producción de ATP y la reasignación de esta energía para apoyar el mantenimiento celular en lugar de impulsar el crecimiento quimioautotrófico. De hecho, la tasa de crecimiento de las bacterias nitrificantes dominantes se redujo en los tratamientos acidificados (reducción de ~25 % y 27 % para Nitrosomonas y Nitrospira, respectivamente) (Figura complementaria 16a,b). Se observó evidencia adicional a nivel transcripcional, ya que los transcritos de genes involucrados en la fijación de CO2 [ciclo de Calvin para Nitrosomonas y ciclo de ácido tricarboxílico reductor para Nitrospira] estaban regulados negativamente de manera ubicua (Texto complementario 3, Fig. 4b, c) 25,27. Sin embargo, las transcripciones de genes involucradas en la vía de fijación de carbono de 3-hidroxipropionato / 4-hidroxibutirato de AOA, que es más energéticamente favorable 24,26, generalmente se regularon al alza en condiciones acidificadas (Fig. 5b, c). De acuerdo con estos resultados, se detectó una abundancia de AOA relativamente mayor en los tratamientos acidificados (P < 0,05) (Fig. 16c complementaria), debido principalmente al crecimiento quimioautotrófico de Nitrosopumilus (el género dominante de AOA) cuya abundancia relativa también aumentó en condiciones acidificadas ( P < 0,05) (fig. 6a). Por lo tanto, la acidificación acuática podría cambiar la comunidad de oxidantes de amoníaco hacia una proporción creciente de AOA sobre AOB. Esta variación también podría ser causada por una mayor afinidad de NH3 de AOA22,64 y la disponibilidad reducida de NH3 en condiciones acidificadas25. Sin embargo, ref. 44 informaron que la composición del conjunto de AOA no era sensible a la acidificación del océano, posiblemente porque el período de incubación (menos de una semana) en su estudio no fue lo suficientemente largo como para causar una rotación significativa en el conjunto.

a Abundancia relativa de microbios nitrificantes basada en la secuenciación del gen 16S rRNA con cebadores universales capaces de detectar bacterias y arqueas dentro de las mismas bibliotecas de secuenciación. El gráfico insertado muestra la abundancia relativa de arqueas oxidantes de amoníaco (Nitrosopumilus y Nitrososphaera). Un solo asterisco indica una diferencia significativa en P < 0,05, mientras que un asterisco doble indica una diferencia significativa en P < 0,01. La barra de error representa SD (n = 3 muestras biológicamente independientes) y los puntos son los puntos de datos correspondientes de las réplicas. b La proporción de transcripciones de genes nitrificantes clave de comammox según los datos de secuenciación del metatranscriptoma. Las líneas horizontales en los gráficos de caja indican el medio, las estrellas representan la media. Los cuadros dan los percentiles 25 y 75, los bigotes muestran el rango de los percentiles 5 a 95 y las curvas muestran la distribución de los valores. Un solo asterisco indica una diferencia significativa en P < 0,05 (n = 6 genes). Las diferencias significativas se determinaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además, las comunidades de bacterias nitrificantes se vieron afectadas por la acidificación (Fig. 6a). La abundancia relativa de Nitrosomonas (la AOB dominante) disminuyó en los tratamientos acidificados (P < 0,05), mientras que la de Nitrospira [la bacteria dominante oxidante de nitrito (NOB), incluida la comammox] aumentó (P < 0,05). Esta mayor proporción general de Nitrospira sobre los oxidantes de amoníaco conocidos indica una proporción creciente de comammox en condiciones acidificadas. De hecho, la abundancia del gen comammox amoA fue mayor en los tratamientos acidificados (P <0.05) (Fig. 16d complementaria). Además, según los datos del metatranscriptoma, se detectaron transcritos del gen comammox más altos en los tratamientos acidificados (0,78-11,59 % del total de transcritos de genes obtenidos involucrados en la oxidación gradual de NH3 a NO3-) en comparación con el control ambiental (solo 0,03-0,89 %, P <0.05) (Fig. 6b y Fig. 17 complementaria). Curiosamente, el aumento fue mayor para las transcripciones de genes involucradas en la oxidación de NH3 a NO2− (amo y hao) que las involucradas en la oxidación de NO2− (nxr) (Fig. 6b), lo que sugiere la posibilidad de que parte del comammox solo pueda servir como oxidantes de amoníaco parciales, en lugar de completos, en condiciones acidificadas. Sin embargo, aún se requieren más investigaciones para probar esta hipótesis. Estos datos demuestran que la acidificación acuática tiene un profundo impacto en las comunidades nitrificantes y su metabolismo fisiológico en los ecosistemas estuarinos y costeros.

En conclusión, nuestros hallazgos sugieren que la acidificación acuática en curso debido a los efectos sinérgicos de la eutrofización inducida por la actividad humana y el CO2 atmosférico elevado podría interrumpir un vínculo vital del ciclo del nitrógeno y aumentar la producción del poderoso gas de efecto invernadero N2O en aguas costeras y estuarinas. Contrariamente a nuestras expectativas, la pCO2 elevada no mostró un efecto de "fertilización con CO2" en los nitrificadores quimioautotróficos en condiciones acidificadas. Los nitrificantes responden significativamente a la acidificación a nivel transcripcional y regulan en gran medida las expresiones génicas asociadas con la homeostasis del pH intracelular para hacer frente al estrés por acidificación. Estos resultados brindan información importante sobre el mecanismo subyacente de la acidificación que afecta la nitrificación y la emisión de N2O asociada, y proponemos que una mayor acidificación en los estuarios y las aguas costeras puede alterar el ciclo del nitrógeno y acelerar el calentamiento global al estimular la emisión de N2O.

El río Yangtze es el río más grande del continente euroasiático en virtud de la descarga de agua y también es el tercer río más largo del mundo. La cuenca del río Yangtze se caracteriza por un rápido desarrollo económico y una alta densidad de población. Debido a las intensas actividades humanas, se ha vertido una cantidad significativa de N reactivo en el estuario del Yangtze y en la zona costera adyacente, lo que ha provocado una grave contaminación por N y una rápida acidificación del agua65. Por lo tanto, se seleccionó el estuario del Yangtze como área de estudio para investigar las respuestas de la tasa de nitrificación y las emisiones de N2O asociadas a la acidificación acuática. Para lograr este objetivo, se seleccionaron seis sitios de muestreo representativos (Yz1 a Yz6) a lo largo del gradiente estuarino desde la desembocadura del estuario hasta la zona costera adyacente.

En este estudio, se recolectaron aguas cercanas al fondo, que típicamente exhiben una nitrificación más activa y una acidificación más severa65,66, de estos sitios durante el crucero de marzo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China en 2020, utilizando botellas Niskin-X montadas en un medidor de conductividad. -perfilador de temperatura-profundidad (CTD) (Sea-Bird 911 plus) (Fig. 1). La profundidad del agua, la salinidad, el pH y el OD se registraron con un perfilador CTD, un medidor de pH (Thermo Orion 3-Star) y el método de Winkler. Parte del agua de cada sitio se conservó en oscuridad a 4 °C para posteriores experimentos de acidificación. Mientras tanto, cantidades conocidas de submuestras se filtraron inmediatamente con filtros estériles de tamaño de poro de 0,22 μm (Waterman), y los filtrados se conservaron para análisis de nutrientes mientras que las membranas se conservaron cuidadosamente a -20 °C para la posterior extracción de ADN (métodos complementarios). También se conservó una cantidad extra de submuestra del sitio Yz3 a 4 °C en la oscuridad para experimentos posteriores de manipulación a largo plazo.

Los experimentos de acidificación se llevaron a cabo en una serie de sistemas de manipulación de flujo continuo (construidos en base a biorreactores, Infors, Suiza, con muestras de agua de 4,0 l y espacio de cabeza de 1,0 l) burbujeando continuamente y suavemente muestras de agua con aire sintético humidificado y filtrado con 0,22 μm. (79 % N2 y 21 % O2): mezclas de CO2 (20 mL min−1, controladas con precisión por un medidor de flujo másico). Las burbujas de aire de entrada:CO2 se dispersaron suavemente en el cuerpo de agua mediante dos agitadores que se instalaron en la parte inferior y por encima del flujo de aire de entrada (~30 rpm), para homogeneizar el sistema de agua y equilibrar las fases líquida y gaseosa. Después del equilibrio, el gas del espacio de cabeza se recolectó de los reactores utilizando jeringas herméticas a los gases para analizar las firmas isotópicas naturales de N2O para revelar las vías de producción de N2O (Métodos complementarios). Posteriormente, se determinaron las tasas de nitrificación mediante la adición de 15NH4Cl (>98 por ciento atómico de 15N, inferior al 20 % de la concentración ambiental) como marcador y la acumulación de 15N en las reservas de NOx− (NO3− + NO2−). Durante las mediciones de velocidad, el pH del agua se mantuvo estable mediante una solución de NaOH 0,2 M a través del regulador automático ácido-base del reactor, ya que se pueden liberar protones (H+) durante el proceso de oxidación del NH3. Mientras tanto, la concentración de OD se mantuvo saturada y la pCO2 se mantuvo en el nivel objetivo a través de un flujo de gas de 100 mL h−1, y el gas de salida se recolectó con bolsas de muestreo de gas (Teflon®FEP, DuPont). La temperatura se mantuvo a temperatura ambiente (25 °C) mediante una placa de calentamiento automático y un baño de agua fría circulante. Durante la incubación, el pH, el OD y la temperatura se registraron en tiempo real a través del sensor de pH equipado (Hamilton, Suiza), el sensor de OD (Hamilton, Suiza) y el sensor de temperatura (Infors, Suiza), respectivamente. Las incubaciones se realizaron en la oscuridad cubriendo los tanques del reactor con papel opaco. Se recogieron muestras líquidas (30 ml) al principio y al final de las 24 h de incubación, con jeringas herméticas a los gases a través de un tubo de muestreo reservado (sujetado herméticamente después del muestreo) y se filtraron inmediatamente (0,22 μm, Waterman). Parte del agua filtrada se utilizó para las mediciones de NO3− y NO2−, mientras que la otra parte se preparó para el análisis de 15NOx− utilizando el "método desnitrificador"67. Además, se recolectaron otras muestras de agua de 30 mL para mediciones de DIC, alcalinidad y pCO2. Mientras tanto, las muestras de gas se extrajeron utilizando jeringas herméticas a gas para mediciones de isótopos de CO2, N2O y N2O. Antes de su uso, las soluciones de reactivo se esterilizaron por filtración (0,22 μm, Waterman), y el tanque del reactor y los materiales relacionados se esterilizaron con calor (121 °C y 15 psi durante 20 min) (lo mismo a continuación). Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Las tasas de nitrificación se calcularon utilizando la siguiente ecuación68:

donde Rnitrificación es la tasa de nitrificación (nmol L−1 h−1), \({R}_{t0}{{{NO}}_{X}}^{-}\) y \({R}_{ t}{{{NO}}_{X}}^{-}\) son las proporciones de 15N en el grupo de \({{{NO}}_{X}}^{-}\) medidas en la reserva inicial (t0) y tiempo final (t) de la incubación, respectivamente. \({\left[{{{NO}}_{X}}^{-}\right]}_{t0}\) y \({\left[{{{NO}}_{X}}^ {-}\right]}_{t}\) son las concentraciones de \({{{NO}}_{X}}^{-}\) en el tiempo inicial (t0) y final (t) del incubación, respectivamente. \({\left[{\!\,}^{14}{{{NH}}_{4}}^{+}\right]}\) y \([{\,\!}^{15 }{{{NH}}_{4}}^{+}]\) representan la concentración ambiental de \({{{NH}}_{4}}^{+}\) y la \({\, \!}^{15}{{{NH}}_{4}}^{+}\) después de la adición del trazador de isótopos estables, respectivamente.

Las tasas de producción de N2O se calcularon con base en el aumento de masa 45 y 46 N2O (\({\,\!}^{45}N_{2}\) y \({\,\!}^{46}N_{2 }\)) durante los experimentos69:

donde \({R}_{{N}_{2}O}\) es la tasa de producción de N2O (pmol N2O-N L−1 h−1). F es la fracción de 15N en la piscina de sustrato (\({{{NH}}_{4}}^{+}\)), como se describe arriba. \({{\,\!}^{45}N_{2}}O_{t0}\) y \({{\,\!}^{45}N_{2}}O_{t}\) indican la cantidad de \({\,\!}^{45}N_{2}O\) en el tiempo inicial (t0) y final (t) de la incubación, respectivamente. \({{\,\!}^{46}N_{2}}O_{t0}\) y \({{\,\!}^{46}N_{2}}O_{t}\) son la cantidad de \({\,\!}^{46}N_{2}O\) en el tiempo inicial (t0) y final (t) de la incubación, respectivamente. V representa el volumen de muestra de agua (L).

Para distinguir los efectos potenciales del aumento de pCO2 y la disminución del pH en las tasas de nitrificación y la producción de N2O asociada bajo acidificación, se construyó una serie de sistemas de manipulación de flujo de aire continuo de manera similar a los experimentos de acidificación. Brevemente, se construyeron cuatro grupos de sistemas de simulación: (a) 400 μatm/pH 8,1 (el grupo de control ambiental), (b) 400 μatm/pH 7,8 (solo reducción de pH, manteniendo pCO2 en el nivel ambiental), (c) 800 μatm/pH 7,8 (el grupo de acidificación), (d) 800 μatm/pH 8,1 (aumento de pCO2 únicamente, manteniendo el pH al nivel ambiental) (Fig. 7 complementaria). Se agregaron 4 L de las muestras de agua recolectadas del sitio Yz3 por reactor, y se agregó 15NH4Cl (>98 por ciento atómico de 15N) a concentraciones inferiores al 20% de NH4+ ambiental. La química del carbonato se manipuló burbujeando constantemente las muestras de agua con aire ajustado con CO2 filtrado a 0,22 μm (400 μatm para los grupos a y b, 800 μatm para los grupos c y d) mientras se ajustaba el pH (7,8 para los grupos b y c, 8,1 para los grupos ayd) con solución estéril ácida (HCl 0,1 M) o básica (NaOH 0,2 M) a través del regulador automático ácido-base del reactor. Otras condiciones de reacción (temperatura, OD, caudal de gas, velocidad de agitación y condiciones de oscuridad) fueron las mismas que en los experimentos de acidificación. Las tasas de nitrificación y las tasas de producción de N2O se midieron como se describe anteriormente durante 24 h de incubación después del equilibrio. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Otros dos grupos de sistemas de manipulación se establecieron de manera similar con muestras de agua del sitio Yz3 para experimentos de acidificación a largo plazo: (a) 400 μatm/pH 8.1 (grupo de control) y (b) 800 μatm/pH 7.8 (grupo de acidificación). La pCO2 y el pH en el cuerpo de agua se manipularon mediante burbujeo continuo con aire ambiental humidificado y filtrado a 0,22 μm (400 μatm, grupo a) o aire enriquecido con CO2 (800 μatm, grupo b), con pH estabilizado en 7,8 u 8,1, respectivamente . Durante los experimentos de acidificación a largo plazo, se complementó NH4+ y se mantuvo en concentraciones ambientales (por debajo de 10 μM) en los reactores (Fig. 10 complementaria). Después de que se consumió aproximadamente la mitad del NH4+, se usaron como medio de cultivo muestras de agua del sitio esterilizadas por filtración con concentraciones adecuadas de NH4+ y se suministraron a una velocidad de flujo de 1 L día−1 a todos los reactores. Se utilizó una solución esterilizada de NaOH de 0,2 M para neutralizar el H+ liberado en el proceso de nitrificación. El DO se mantuvo saturado y la temperatura se mantuvo a 25 °C como se describe anteriormente. Durante la incubación, se recogieron diariamente muestras líquidas (10 ml) de los reactores y se filtraron inmediatamente (0,22 μm, Waterman) para las mediciones de NH4+, NO3− y NO2−. También se recolectaron 2 ml del gas del espacio de cabeza todos los días utilizando jeringas herméticas al gas para análisis de N2O y CO2. Se recogió una cantidad conocida de muestra cada varios días y se sedimentó mediante centrifugación (20.000 g, 5 min). Los sedimentos se usaron inmediatamente para la extracción de ADN y los posteriores ensayos de pirosecuenciación y qPCR (Métodos complementarios, Tabla complementaria 10). También se recolectaron submuestras cada semana para medir las tasas de nitrificación y producción de N2O. Al final de la incubación de un mes, las muestras se recolectaron, sedimentaron (20 000 g durante 5 min, a 2 °C) y se criopreservaron inmediatamente en nitrógeno líquido para análisis metatranscriptómicos posteriores.

Para el enriquecimiento de AOA, se instaló un biorreactor nitrificante de flujo continuo (Infors, Suiza) con un volumen de trabajo de 4,0 L con muestras de agua dulce del sitio Yz3. El agua del sitio esterilizado por filtración suplementada con NH4+ (~10 μM) y estreptomicina (~50 mg/L, para inhibir las bacterias nitrificantes70,71) se suministró continuamente a un caudal de ~0,5 L día−1. La concentración de OD se mantuvo saturada lavando continuamente con aire. El pH se mantuvo a 8,1 con solución de KHCO3 0,2 M a través del regulador automático ácido-base del reactor. Las incubaciones se realizaron en la oscuridad y la temperatura se mantuvo a 25 °C como se describe anteriormente. Durante la incubación, se recogieron muestras líquidas del reactor y se filtraron inmediatamente utilizando filtros de tamaño de poro de 0,22 μm (Waterman) para la medición de NH4+, NO3− y NO2−. Además, se recogieron muestras (20.000 g, 5 min) para extracción de ADN y posterior pirosecuenciación para monitorizar el enriquecimiento de AOA (Supplementary Methods). Después de 50 días de incubación, se cosechó el cultivo de enriquecimiento de AOA para medir las tasas de nitrificación y emisión de N2O.

Las muestras líquidas recolectadas de los reactores se centrifugaron (6000 g, 5 min) para recolectar la biomasa enriquecida con nitrificantes27. Luego, la biomasa precipitada en el fondo del tubo de centrífuga se lavó tres veces usando agua del sitio esterilizada por filtración y se volvió a suspender antes de las mediciones de velocidad. Posteriormente, se transfirieron 100 μl de esta suspensión a viales de vidrio herméticos a los gases (120 ml) en los que se burbujearon suficientemente 10 ml de agua fresca esterilizada por filtración con NH4+ (concentración final de ~10 μM) con aire ajustado con CO2 (400 μatm o 800 μatm). Durante la incubación, el pH se mantuvo en el nivel objetivo mediante la adición de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS, pH ajustado a 8,1 o 7,8, concentración final 20 mM)23. Los viales se incubaron en la oscuridad a 25 °C en un agitador orbital (30 rpm). En cada intervalo de muestreo (0, 5, 8, 12 y 24 h), se sacrificaron tres réplicas y se extrajeron 2 ml del gas del espacio de cabeza para los análisis de CO2 y N2O. El pH y el OD objetivo se confirmaron utilizando un medidor de pH Mettler-Toledo y un medidor OXY S/N 4164 con un sensor de aguja de oxígeno (Unisense), respectivamente. Mientras tanto, se filtraron inmediatamente 5 ml de suspensión en cada vial (0,22 μm, Waterman) para las mediciones de NOx−. Las tasas de nitrificación se estimaron sobre la base de los cambios lineales en las concentraciones de NOx− con el tiempo23. La inhibición de la actividad de nitrificación se expresó como el porcentaje de reducción de la tasa de nitrificación en los tratamientos acidificados en comparación con el control ambiental. El efecto de la acidificación sobre la emisión de N2O se determinó con base en el cambio porcentual de la concentración de N2O (en el espacio superior de los viales de vidrio) en los tratamientos acidificados en relación con el control ambiental23.

El ARN total se extrajo de controles ambientales por triplicado (400 μatm/pH 8,1) y tratamientos acidificados (800 μatm/pH 7,8) utilizando el kit EZNA® Soil RNA (Omega Bio-tek, Norcross, GA, EE. UU.) al final de la incubación. El ADN genómico residual se eliminó con el kit Turbo DNA-free (Ambion) y luego se verificó mediante PCR usando los cebadores 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) y 909R (5′-CCCCGYCAATTCMTTT RAGT-3′) para descartar contaminación por ADN23. La pureza, integridad y concentración del ARN extraído se midieron con Agilent2100 (Agilent) y Nanodrop2000 (Thermo). A continuación, se eliminó el ARN ribosómico (ARNr) a través del kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero (Epicentre) para adquirir ARNm calificado, que se usó para análisis de qPCR (métodos complementarios) y secuenciación de metatranscriptoma.

Las bibliotecas de ADNc metatranscriptómico se construyeron con el kit de preparación de muestras de ARN TruSeq (Illumina) y se secuenciaron en una plataforma Illumina HiSeq4000 después de que las muestras de ARNm por triplicado de los controles ambientales y los tratamientos acidificados se agruparan individualmente72. La calidad de las lecturas sin procesar se verificó a través de FastQC y se recortó con SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep). Posteriormente, las lecturas sin procesar se filtraron por calidad utilizando Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) y las secuencias con bases ambiguas (N), baja calidad (por debajo de 20) y longitudes inferiores a 50 pares de bases (pb) fueron descartados. SortMeRNA (http://bioinfo.lifl.fr/RNA/sortmerna/) se usó además para detectar y eliminar las lecturas de ARNr. Las lecturas limpias de ARNm de alta calidad resultantes se ensamblaron utilizando la canalización de ensamblaje Trinity de novo (se eliminaron los contigs de menos de 200 pb)73. Se usó MetaGeneMark (http://exon.gatech.edu/meta_gmhmmp.cgi) para predecir marcos de lectura abiertos (ORF) y los que tenían más de 100 pb se tradujeron en secuencias de aminoácidos. Los contigs no redundantes (95 % de identidad; 90 % de cobertura) se obtuvieron a través del software CD-HIT (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/). Los niveles de expresión de las transcripciones se calcularon a través de kallisto (https://pachterlab.github.io/kallisto/) y se informaron como TPM (Transcripciones por millón de kilobases). Se calculó el cambio de veces (FC) en la expresión génica relativa comparando los tratamientos acidificados con el control ambiental. Las afiliaciones taxonómicas de las transcripciones se asignaron mediante agrupamiento al mejor éxito en la base de datos NR (BLASTP, valor e ≤ 10-5). Las funciones potenciales se asignaron en función de la mejor homología con las proteínas dentro de la base de datos KEGG (Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto) (BLASTP, valor e ≤ 10-5). El árbol de máxima verosimilitud se construyó con IQ-TREE74 con 1000 arranques ultrarrápidos y luego se visualizó y anotó mediante iTOL (árbol de vida interactivo)75.

Las concentraciones de CO2 y N2O se monitorearon mediante cromatografía de gases (GC-2014, Shimadzu, Kyoto, Japón). Las relaciones de isótopos de N2O (m/z = 44, 45, 46) se analizaron en espectrometría de masas de relación de isótopos (IRMS, Delta V Advantage, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Las firmas isotópicas naturales de N2O (δ15Nbulk, δ15Nα y δ18O) para revelar las vías de producción de N2O se analizaron en IRMS (Delta V Plus, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemania). Las concentraciones de NH4+, NO3− y NO2− se midieron colorimétricamente utilizando un analizador de nutrientes de flujo continuo (Skalar SANplus, Skalar Analytical BV, Breda, Países Bajos) con límites de detección de 0,3 μM para NH4+-N y 0,05 μM para NO2−-N y NO3−-N. La concentración de DIC se analizó por acidificación y posterior cuantificación del CO2 liberado (coulómetro de carbono, UIC-INC, América). La alcalinidad y la pCO2 se calcularon a través del programa CO2SYS76, sobre la base de las mediciones de pH y DIC utilizando las constantes de disociación del ácido carbónico de la ref. 77 que fueron reacondicionados en diferentes formas funcionales por la ref. 78.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando SPSS versión 19.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL. EE. UU.). Las diferencias significativas entre los grupos tratados de manera diferente se identificaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba honesta de Tukey. Se construyeron curvas ajustadas no lineales (ajuste polinomial) utilizando Origin 2022b para explorar las respuestas de la nitrificación y las tasas de producción de N2O asociadas a diferentes niveles de acidificación. Los resultados se consideraron significativos cuando P < 0,05.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de secuencias y la información de las muestras están disponibles en la base de datos del archivo de lectura de secuencias (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con los números de acceso de BioProject PRJNA876082. Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o en los Materiales Complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 41725002 [LJH], 41971105 [YLZ], 42222605 [YLZ], 42030411 [LJH], 42249903 [LJH], 41671463 [LJH] y 41730646 [ML] ), los Programas Nacionales Clave de China para la Investigación y el Desarrollo Fundamentales (No. 2016YFA0600904) [LJH], y el Fondo del Director del Laboratorio Clave de Ciencias de la Información Geográfica (Ministerio de Educación), Universidad Normal del Este de China (Subvención No. KLGIS2022C03) [YLZ] . Las muestras se recolectaron durante los cruceros de investigación abiertos al estuario del Yangtze (NORC2020-03 y NORC2023-302). Agradecemos a WS Gardner y Silvia E. Newell por la discusión y revisión del manuscrito.

Estos autores contribuyeron por igual: Jie Zhou, Yanling Zheng.

State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, Yangtze Delta Estuarine Wetland Ecosystem Observation and Research Station, East China Normal University, Shanghái, 200241, China

Jie Zhou, Yanling Zheng, Lijun Hou, Zhirui An, Feiyang Chen, Bolin Liu, Hongpo Dong, Xia Liang, Xiaofei Li y Dengzhou Gao

Facultad de Ciencias Geográficas, Universidad Normal del Este de China, Shanghái, 200241, China

Yanling Zheng, Li Wu, Lin Qi, Ping Han, Guoyu Yin, Yi Yang, Ye Li y Min Liu

Laboratorio Clave de Ciencias de la Información Geográfica (Ministerio de Educación), Universidad Normal del Este de China, Shanghái, 200241, China

Yanling Zheng, Li Wu, Lin Qi, Ping Han, Guoyu Yin, Yi Yang, Ye Li y Min Liu

Laboratorio clave de análisis de datos masivos espacio-temporales y aplicación de recursos naturales en megaciudades, Ministerio de Recursos Naturales, Shanghái, 200241, China

Yanling Zheng, Ping Han, Guoyu Yin, Yi Yang, Ye Li y Min Liu

Instituto de Ciencias Marinas de la Universidad de Texas en Austin, Port Aransas, TX, 78373, EE. UU.

Zhanfei Liu

Instituto Noruego para la Investigación del Agua, Thormøhlensgt 53D, 5006, Bergen, Noruega

Richard Bellerby

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YLZ, LJH y ML concibieron la investigación. JZ, YLZ, LJH, ZRA, FYC, BLL, LW y LQ realizaron la investigación. JZ, YLZ, LJH, HPD, PH, GYY, XL, YY, XFL, DZG, YL, ZFL, RB y ML analizaron los datos. JZ, YLZ, LJH, RB y ML escribieron el artículo.

Correspondencia a Yanling Zheng, Lijun Hou o Min Liu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Yong-guan Zhu y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhou, J., Zheng, Y., Hou, L. et al. Efectos de la acidificación sobre la nitrificación y la emisión de óxido nitroso asociada en aguas estuarinas y costeras. Nat Comun 14, 1380 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37104-9

Descargar cita

Recibido: 16 Septiembre 2022

Aceptado: 28 de febrero de 2023

Publicado: 13 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37104-9

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