Tricloroacetimidatos de bencilo como agentes derivatizantes de ácidos fosfónicos relacionados con agentes nerviosos por IE

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 21299 (2022) Citar este artículo

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Se presenta el uso de tricloroacetimidatos de bencilo para la bencilación de marcadores de agentes nerviosos de ácido fosfónico en condiciones neutras, básicas y ligeramente ácidas. Los ácidos fosfónicos derivados de bencilo se detectaron y analizaron mediante cromatografía de gases de ionización electrónica-espectrometría de masas (EI-GC-MS). Los ácidos fosfónicos utilizados en este trabajo incluyen ácido etil-, ciclohexil- y pinacolil metilfosfónico, productos de hidrólisis de primer paso de los agentes nerviosos N-2-diisopropilaminoetilo metilfosfonotiolato de etilo (VX), ciclosarina (GF) y soman (GD) respectivamente. La optimización de los parámetros de reacción para la bencilación incluyó el tiempo de reacción y el disolvente, la temperatura y el efecto de la ausencia o presencia de ácido catalítico. Las condiciones optimizadas para la derivatización de los ácidos fosfónicos específicamente para su bencilación incluyeron ácido tanto neutro como catalítico (< 5% mol) y 2,2,2-tricloroacetimidato de bencilo en exceso acoplado al calentamiento de la mezcla a 60 °C en acetonitrilo durante 4 h. Mientras que las condiciones neutras para el método demostraron ser eficientes para la preparación de los ésteres p-metoxibencílicos de los ácidos fosfónicos, el proceso catalizado por ácido pareció proporcionar rendimientos mucho más bajos de los productos en relación con su equivalente bencílico. La eficiencia del método se probó en la derivatización e identificación exitosas del ácido pinacolil metilfosfónico (PMPA) como su éster bencílico cuando está presente en una concentración de ~ 5 μg/g en una matriz de suelo incluida en la Organización para la Prohibición de las Armas Químicas (OPAQ) 44a prueba de competencia (PT). Además, el protocolo se utilizó en la detección e identificación de PMPA cuando se añadió a una concentración de ~ 10 μg/mL en una matriz líquida rica en ácidos grasos que se presentó durante la 38.ª OPAQ-PT. El derivado de bencilo de PMPA se corroboró parcialmente con la biblioteca de espectros NIST interna del instrumento y la base de datos analítica central de la OPCW (OCAD v.21_2019), pero se identificó sin ambigüedades mediante la comparación con un estándar auténtico sintetizado. Se determinó que los valores MDL (LOD) del método para los ácidos bencilo y p-metoxibencil pinacolil metilfosfónico eran 35 y 63 ng/ml respectivamente, mientras que el límite de cuantificación (LOQ) del método se determinó que era 104 y 189 ng/ml respectivamente en la matriz del suelo OPAQ-PT evaluada.

Recientemente, el uso deliberado de agentes nerviosos a base de organofosforados (OPNA) en intentos de asesinato exitosos y fallidos en el mundo1,2,3 ha resultado en un resurgimiento de los esfuerzos de investigación hacia el desarrollo de contramedidas médicas contra estos químicos letales4,5,6 , métodos para su descontaminación7,8 y vías alternativas más eficaces para su análisis y detección por diversos métodos analíticos9,10. Dentro del paraguas de las OPNA, los agentes de las series G y V representan uno de los más empleados históricamente dentro y fuera de los conflictos militares. Tres eventos mundiales importantes que ilustran su uso contra objetivos civiles son el uso de sarín durante el ataque al sistema subterráneo de Tokio11,12, el ataque químico de Ghouta en Siria13,14 y el uso de VX en el asesinato de Kim Jong Nam en el aeropuerto de Kuala Lumpur. en Malasia15. Los agentes nerviosos pueden detectarse mediante GC-MS en su forma intacta, ya que son líquidos a temperatura ambiente y, por lo tanto, volátiles cuando se someten a las altas temperaturas del instrumento. Ahora bien, aunque algunos agentes nerviosos disfrutan de perfiles de estabilidad más pronunciados que otros, el mecanismo por el cual todos estos se degradan, en condiciones básicas u oxidativas, es bastante predecible16. En consecuencia, todos los OPNA que pertenecen a las series G y V experimentan una hidrólisis que se caracteriza por la escisión de los enlaces PF (p. ej., GD, GF) o P-CN (p. ej., GA) en agentes basados ​​en G, mientras que la mayoría de los la vía hidrolítica para los agentes de la serie V (p. ej., VX, VR) implicará la escisión del enlace P–S16,17,18. El evento de hidrólisis da lugar a la formación de semiésteres de ácido metilfosfónico que, debido a su relación inmediata con el agente nervioso, se han convertido en una de las especies más estudiadas en el campo del análisis de guerra química por GC-MS19,20 (Fig. 1a). como en el análisis de firma de atribución química de OPNA por varios métodos analíticos21,22,23,24. Sin embargo, la detección directa de estos productos de hidrólisis es problemática debido a su baja volatilidad, por lo que se han desarrollado varios métodos para su derivatización que incluyen la sililación25,26 y la alquilación en forma de metilación27,28,29,30 y bencilación31,32. Estos métodos han demostrado ser herramientas químicas esenciales en el campo del análisis de productos de degradación de GC-MS y OPNA y, como tales, han disfrutado de numerosos emprendimientos de investigación en el desarrollo de agentes de derivatización eficientes para su exitoso análisis de GC-MS16. Un método en particular, la bencilación, se ha convertido en una reacción básica de derivatización de los ácidos fosfónicos, proporcionando aductos que otorgan al ácido fosfónico un peso molecular más alto y, por lo tanto, un tiempo de retención más prolongado en la columna, así como una mayor volatilidad33. El método establecido para la introducción del grupo bencilo implica el uso de una base, generalmente carbonato de sodio o potasio, para desprotonar el ácido fosfónico seguido de una reacción con un haluro de bencilo (p. ej., bromuro de bencilo) con calentamiento durante la noche a 70 °C34 (Fig. .1b). Esta reacción es eficiente y funciona bien en condiciones básicas que podrían crear algunos problemas al tratar con especies sensibles a las bases presentes en una matriz que podría estar relacionada con otro agente de guerra química de interés. Con este fin, un protocolo para la bencilación de ácidos fosfónicos en condiciones neutras o ligeramente ácidas podría proporcionar a los analistas una forma alternativa de introducir el resto bencilo en los ácidos fosfónicos. El método aquí presentado emplea dos reactivos, bencil- y p-metoxibencil-2,2,2-tricloroacetimidato, para la formación de ésteres bencílicos de ácidos fosfónicos relacionados con OPNA (Fig. 1c).

(a) Hidrólisis de los agentes nerviosos basados ​​en organofosforados VX, GD y GB para producir ácido etilmetilfosfónico (EMPA), ácido pinacolilmetilfosfónico (PMPA) y ácido ciclohexilmetilfosfónico (CMPA) respectivamente. Métodos de bencilación para ácidos fosfónicos usando (b) bromuro de bencilo en presencia de una base y (c) usando tricloroacetimidatos de bencilo y p-metoxibencilo en condiciones neutras, básicas o ácidas.

Las derivatizaciones en forma de alquilaciones como las metilaciones35,36,37 y las bencilaciones se han convertido en una práctica común en el análisis por GC-MS de especies que en su forma nativa son marginalmente detectables por la técnica. Como estas dos reacciones de alquilación han recibido la mayor atención, no sorprende que la mayoría de las bibliotecas de instrumentos como NIST38,39 y la base de datos analítica central de la OPAQ (OCAD)40 hayan acumulado una gran colección de ácidos fosfónicos metilados y bencilados que son cruciales en la rutina. e identificación de escenarios de casos reales de estos productos de degradación de agentes nerviosos. En general, la bencilación de ácidos fosfónicos para su posterior análisis por métodos GC-MS se realiza en condiciones básicas y utilizando un haluro de bencilo (p. ej., bromuro de bencilo o bromuro de pentafluorobencilo)33,41,42. La base empleada en estos casos podría ser de naturaleza orgánica o inorgánica, conduciendo ambas a la formación de especies de ácido fosfónico bencilado con buenos rendimientos. El beneficio adicional de usar una base inorgánica, como el carbonato de potasio, es que proporciona espectros de masas más limpios en contraste con los orgánicos, como la trietilamina, que podrían interferir con las señales clave, ya que normalmente se usan en exceso durante la derivatización. Como método alternativo para la instalación del grupo bencilo, recurrimos a los tricloroacetimidatos de bencilo43,44, que son formas activadas de alcohol bencílico que pueden reaccionar de manera similar a los bromuros de bencilo en la bencilación de sustratos, pero en este caso en condiciones neutras a ácidas. Otra característica atractiva de los tricloroacetimidatos es que, en la mayoría de los casos, son líquidos estables a temperatura ambiente, lo que hace conveniente su uso en derivatizaciones, ya que se elimina el pesaje de sólidos. Los tres ácidos fosfónicos elegidos para los estudios de este trabajo fueron los ácidos etil-, ciclohexil- y pinacolil metilfosfónico, que son los productos de hidrólisis de los agentes nerviosos N-2-diisopropilaminoetilo metilfosfonotiolato de etilo (VX), ciclosarina (GF) y soman (GD) respectivamente.

Uno de los primeros pasos para demostrar la viabilidad del uso de tricloroacetimidatos de bencilo para la derivatización de ácidos fosfónicos fue encontrar las condiciones más óptimas para la reacción. Después de determinar la viabilidad de la derivatización usando condiciones similares (ACN/60 °C/2 h) a otros protocolos de derivatización (p. ej., sililación mediada por BSTFA), la temperatura de la reacción se convirtió en el primer parámetro a evaluar. Se encontró que la reacción produjo la mayor cantidad de producto para cada ácido fosfónico evaluado cuando se llevó a cabo a 60 °C, sin embargo, se encontró que los productos de éster bencílico sustanciales de cada ácido fosfónico también se acumularon a 40 °C (Fig. 2a) en un tiempo establecido de 2 h. Después de que se determinó que la temperatura (60 °C) era óptima para la reacción cuando se llevó a cabo durante solo 2 h, se determinó el rendimiento de la reacción para cada éster bencílico para cada ácido fosfónico con respecto al tiempo. Los tiempos evaluados para la optimización fueron 2, 4, 6 y 8 h. Se encontró que la reacción produjo un producto de éster bencílico significativo para cada ácido fosfónico después de 4 h y que la acumulación de estos productos no experimentó un mayor aumento luego de un tiempo de reacción prolongado (hasta 8 h) (Fig. 2b). Por lo tanto, estos datos muestran que se puede realizar un análisis GC inicial a las 4 h de la derivatización y, dependiendo de la concentración del analito, se pueden aplicar períodos de tiempo prolongados para la derivatización (hasta 8 h) para aumentar el rendimiento de la derivación. ácidos fosfónicos bencilados. Después de optimizar estos dos primeros parámetros (temperatura y tiempo), dirigimos nuestra atención a evaluar el efecto del solvente utilizado en la reacción, así como el impacto de realizar la reacción en condiciones de ácido catalítico neutro, básico y agregado. Los últimos dos parámetros establecidos para la optimización involucraron solo PMPA. Por lo tanto, los solventes en los que se probó la reacción de bencilación incluyeron solventes comúnmente usados ​​para análisis GC-MS como diclorometano (DCM, pe: 40 °C), acetonitrilo (pe: 82 °C), acetona (pe: 56 °C) y acetato de etilo (EtOAc, pe: 77 °C). Se observó que la bencilación de PMPA procedía de manera más eficiente cuando se usaban acetonitrilo y acetona como disolventes en contraste con DCM y EtOAc, donde se encontró que el rendimiento de los ésteres bencílicos era claramente inferior al reflejar los resultados publicados previamente27 (Fig. 2c). No obstante, todavía se observó una formación significativa del producto en estos otros disolventes. A partir de estos datos, se decidió realizar la reacción en acetonitrilo durante el último conjunto de reacciones de optimización de parámetros que implicaban la ausencia y el uso del aditivo ácido y la base también. Se descubrió que la bencilación de PMPA funciona sin problemas en condiciones básicas, lo que produce BPMPA en cantidades comparables a las obtenidas con ácido catalítico agregado (5% en moles de tricloroacetimidato), así como cuando ningún aditivo formaba parte de la ecuación (Fig. 2d). Las condiciones en las que no se colocó ningún aditivo en la mezcla se denominaron neutras; sin embargo, aunque no implican la presencia de un ácido o una base, la mezcla es de naturaleza ácida debido a la sola presencia del propio ácido fosfónico. En consecuencia, se puede prever que el ácido fosfónico pueda actuar como catalizador para la bencilación fuera de cualquier aditivo ácido (Fig. 2e). En última instancia, el protocolo produce tres productos bencilados que se pueden encontrar en la biblioteca NIST interna del instrumento, así como en la biblioteca OCAD y estos son, junto con sus tiempos de retención, ácido bencil etil metilfosfónico BEMPA (t = 19,15 min.), bencil pinacolil metilfosfónico ácido BPMPA (t = 22,42 y 22,69 min.) y ácido bencil ciclohexil metilfosfónico BCMPA (t = 25,26 min.)

Reacciones de optimización, áreas de pico promedio (n = 3) (± la desviación estándar) para el ácido fosfónico bencilado después de que el ácido (0,8 μmol, [100 ppm]) se trata con tricloroacetimidato (200 μL, exceso) en acetonitrilo (ACN, 1 mL), que incluía (a) el efecto de la temperatura en la derivatización produce resultados similares para calentamiento suave (40 °C) y calentamiento a 60 °C durante 4 h; (b) tiempo para la reacción donde se puede observar una acumulación máxima de los tres productos bencilados a las ~ 4 h; (c) los estudios sobre PMPA solo revelan que el acetonitrilo y la acetona son disolventes óptimos para la derivatización sobre DCM y EtOAc; (d) el efecto de la ausencia de aditivos ("neutros"), base (20 mg, exceso) y ácido catalítico (TFA y AcOH, 0,08 μmol (10 % mol en relación con el ácido fosfónico) en la reacción demuestra que la reacción funciona bien bajo todos los estas condiciones; (e) mecanismo propuesto para la reacción cuando no se agrega ácido o base, con el ácido fosfónico actuando como la especie activadora para el tricloroacetimidato.

Otro tricloroacetimidato incluido en nuestros estudios fue el tricloroacetimidato de p-metoxibencilo. La reacción entre el tricloroacetimidato de p-metoxibencilo y los ácidos fosfónicos ocurre a través del mismo mecanismo que el descrito para el tricloroacetimidato de bencilo (Fig. 2e), pero el éster de ácido fosfónico resultante está compuesto por una unidad de bencilo que tiene un sustituyente metoxi en su anillo aromático. La razón detrás de explorar este otro tricloroacetimidato es el uso potencial del resto p-metoxibencilo (PMB) para mejorar la detección del ácido fosfónico en relación con la contraparte bencilo no sustituido en virtud de sus capacidades de captura de electrones33. Sin embargo, es esta sustitución de anillo la que también hace que el grupo p-metoxibencilo sea lábil frente a ácidos suaves43,44, lo que requiere el uso de una base para que la reacción muestre cierto grado de éxito. Los tres productos que surgen de esta derivatización específica junto con sus tiempos de retención entre paréntesis son ácido p-metoxibencil etil metilfosfónico PMB-EMPA (t = 22,77 min.), ácido p-metoxibencil pinacolil metilfosfónico PMB-PMPA (t = 25,57 y 25,85 min .) y ácido p-metoxibencil ciclohexil metilfosfónico PMB-CMPA (t = 28,23 min.). Se puede observar a partir de los resultados en la Fig. 3a-c, que la instalación del grupo p-metoxibencilo en los ácidos fosfónicos en función de la temperatura, el tiempo y el medio solvente es muy similar a la que muestra su contraparte de tricloroacetimidato de bencilo ( Fig. 2) en condiciones básicas. Por lo tanto, la p-metoxibencilación parece proporcionar un rendimiento significativo de los ácidos fosfónicos bencilados a 40 °C y después de 4 h (Fig. 3a,b) con una ligera mejora del rendimiento con el aumento de la temperatura (es decir, 60 °C) o tiempo de reacción prolongado ( hasta 8h). En cuanto al desempeño de la reacción en diferentes solventes, nuevamente se encontró que el acetonitrilo y la acetona fueron los medios más óptimos para que se llevara a cabo la derivatización. Por último, la labilidad ácida del grupo p-metoxibencilo en relación con la de su homólogo bencilo tiene un efecto perjudicial en el rendimiento de la reacción, como se aprecia en la Fig. 3d. Por lo tanto, se puede inferir de los resultados en la Fig. 3d que incluso el uso catalítico de ácido no ayuda en la esterificación de PMPA ya que el medio ya es de naturaleza ácida y aunque se puede detectar algo de p-metoxibencil PMPA, esta cantidad es mínimo en comparación donde se agrega una base (Na2CO3) en exceso para contrarrestar los efectos hidrolíticos del ácido (Fig. 3d).

Derivatización de ácidos fosfónicos con tricloroacetimidato de p-metoxibencilo: Reacciones de optimización, áreas de pico promedio (n = 3) (± la desviación estándar) para el ácido fosfónico p-metoxibencilado después de que el ácido (0,8 μmol, [100 ppm]) se trata con el tricloroacetimidato (200 μL, exceso) en acetonitrilo (ACN, 1 mL), (a) el efecto de la temperatura en la derivatización que produce resultados similares para calentamiento suave (40 °C) y calentamiento a 60 °C durante 4 h; (b) tiempo para la reacción donde se puede observar una acumulación máxima de los tres ácidos p-metoxibencilados a las ~ 4 h; (c) los estudios sobre PMPA solo revelan que el ACN y la acetona son nuevamente solventes óptimos para la derivatización; y (d) el efecto de la ausencia de aditivos ("neutros"), base (20 mg, exceso) y ácido catalítico (TFA y AcOH, 0,08 μmol (10 % mol en relación con el ácido fosfónico) en la reacción demuestra que la reacción funciona bien solo en condiciones básicas debido presumiblemente a la mayor naturaleza sensible a los ácidos del grupo PMB.

La comparación espectral de masas de ambos derivados de PMPA muestra características muy interesantes que reflejan su composición estructural única que ayuda en gran medida al analista en el análisis de este importante marcador de degradación del agente nervioso (Fig. 4). Comenzando con los tiempos de retención asociados con ambos compuestos PMPA bencilados, se puede observar que estos son muy diferentes con tiempos de retención de 25,57 y 25,85 min para PMB-PMPA (Fig. 4a), mientras que los tiempos de retención para BPMPA fueron 22,42 y 22,69. mín. Como era de esperar, el perfil de GC-MS para derivados de PMPA aparece como dos señales que surgen de la mezcla diastereoisómera de los ácidos28,29. El análisis del espectro de masas para PMB-PMPA muestra dos características clave, la primera es que un pico de iones moleculares (m/z = 300,3) es claramente visible y que el pico base es m/z = 121,1 asignado al tropilio sustituido con metoxi catión (Fig. 4b). Otros picos de interés en el espectro de PMB-PMPA incluyen el pico en m/z = 216,1, que es un fragmento que surge de la pérdida de la cadena lateral alquílica del resto de pinacolilo para producir un ácido fosfónico sustituido con PMB (C9H13O4P) y m/z = 137.1 perteneciente a la unidad lateral PMB-O de PMB-PMPA con fórmula tentativa de C8H9O2 (Fig. 4b). Por el contrario, el espectro de masas para BPMPA muestra pocos picos, pero dos de ellos son muy intensos (Fig. 4d). El primero es el pico base (m/z = 186,1) que es un fragmento que surge de la pérdida de la cadena lateral alquílica del resto pinacolilo para producir un ácido fosfónico sustituido con bencilo (C8H11O3P) y m/z = 91,1 que indica la formación del ion tropilio. Como era de esperar durante los análisis de EI-GC-MS, es posible que no se observe el pico de iones moleculares para algunos derivados y este es el caso de BPMPA (m/z = 270) (Fig. 4d).

Trazas de GC-MS y espectros de masas asociados para PMB-PMPA y BPMPA. Los datos de GC-MS se recopilaron en estándares sintetizados. Obsérvese la resolución de ambos diastereómeros de PMPA por la columna como resultado de los dos centros estereogénicos en la molécula, el átomo de P y el átomo de C en el brazo de pinacolilo marcado con un asterisco (*).

El ácido pinacolil metilfosfónico representa el primer producto de degradación del agente nervioso Soman (GD) y dependiendo de las condiciones ambientales o biológicas donde se encuentre, podría ser la especie más abundante derivada de este agente nervioso además del ácido metilfosfónico. Soman es un agente nervioso perteneciente a la serie G que posee el tiempo de envejecimiento más corto una vez que se une a la enzima acetilcolinesterasa (AChE) y como tal se ha convertido en uno de los más letales entre los ya muy tóxicos agentes nerviosos45. Aparte de esta característica letal, GD y PMPA en forma derivatizada tienen un comportamiento único durante los análisis de GC-MS y es que siempre se observan dos señales para estos analitos, ya que existen como una mezcla diastereoisómera28,29. Esta es una característica única, ya que GD es el único agente nervioso de la serie G que posee dos centros quirales (en los centros C y P) y, como tal, se ha convertido en un analito que aparece constantemente durante las pruebas de competencia (PT) de la OPAQ. El objetivo principal durante un OPCW-PT es la eventual detección e identificación de productos de degradación relacionados con agentes de guerra química. Durante estos PT, es importante no solo detectar sino identificar sin ambigüedades un analito comparando su tiempo de retención cromatográfica y su espectro de masas con los de un químico de referencia conocido, ya sea en su forma nativa o derivatizada46.

Por lo tanto, después de demostrar la capacidad del método para convertir los ácidos fosfónicos en sus correspondientes ésteres de bencilo, centramos nuestra atención en probar su rendimiento en una muestra de suelo presentada en la 44.ª OPCW-PT35. La muestra de suelo PT, designada con el código PT-S2, contenía dentro de su matriz el compuesto notificable ácido pinacolil metilfosfónico (PMPA, Schedule 2.B.04) que luego se descubrió que estaba enriquecido en una concentración de 50 μg/g. La muestra de suelo se combinó con la matriz de suelo que se entrega al laboratorio participante como muestra en blanco para generar una muestra diluida llamada PT-S2* que ahora contenía PMPA en una concentración de 5 μg/g. La muestra de suelo PT-S2, además de contener materia orgánica detectable por GC-MS, también se enriqueció con una serie de hidrocarburos homólogos, presumiblemente para actuar como especies de interferencia durante los análisis de PT. El protocolo consistió en tomar la matriz de suelo PT-S2* en ACN (2 mL) y tratar la suspensión simultáneamente con Na2CO3 (20 mg) y 2,2,2-tricloroacetimidato de bencilo (40 μL). La mezcla resultante se calentó en un bloque de calor durante 4 h, se filtró, el filtrado de ACN se concentró con una corriente de nitrógeno a ~ 150 μL y se analizó por GC-MS. Como se puede ver en la Fig. 5a, la formación de BPMPA utilizando el protocolo optimizado se puede observar cuando el PMPA está en una concentración tan baja (5 μg/g). Un análisis cuidadoso del espectro de masas que surge de cualquiera de los picos que sobresalen entre las diversas interferencias del suelo muestra que, de hecho, estos picos surgen del producto PMPA bencilado (Fig. 5b). Los valores MDL del método para los ácidos bencilo y p-metoxibencil pinacolil metilfosfónico para esta matriz se determinaron en 35 y 63 ng/mL respectivamente siguiendo las pautas establecidas por la EPA (EPA-821-R16-006). Además, utilizando las mismas pautas, se determinó que el LOQ para el método para los ácidos bencilo y p-metoxibencil pinacolil metilfosfónico era de 104 y 189 ng/mL respectivamente (Tabla 1).

Análisis GC-MS en muestra de suelo PT-S2* que contiene PMPA a una concentración de ~ 5 μg/g. (a) Cromatograma de gases que muestra la formación del producto bencílico BPMPA (indicado por ambos asteriscos); (b) espectro de masas de BPMPA.

Se probó la eficacia del método en la bencilación de PMPA en una matriz líquida rica en ácidos grasos presentada en el 38º OPCW-PT28. La muestra líquida presentada durante este PT (código: CW-O3) administrada en 2015 consistió en una serie de sustancias químicas programadas que incluían alcohol pinacolílico47,48, el otro producto de hidrólisis final de PMPA además del ácido metilfosfónico enriquecido en una matriz rica en ácidos grasos que hizo extremadamente difícil su análisis e identificación. Los enfoques de derivatización que incluían sililación y metilación se llevaron a cabo con un éxito limitado, lo que obligó a realizar esfuerzos que incluyeron una purificación previa de la matriz mediante cromatografía en columna utilizando gel de sílice y hexanos como disolvente de elución. Para nuestros estudios en este documento, se agregó PMPA en esta matriz a una concentración de ~ 10 μg/mL. El tratamiento de la matriz enriquecida con exceso de tricloroacetimidato de bencilo a 60 °C durante 4 h dio como resultado la formación de BPMPA (Fig. 6). Curiosamente, la biblioteca interna del NIST en nuestro instrumento no pudo proporcionar una coincidencia clara con BPMPA, igualando su espectro de masas con el del ácido n-butilbencilfosfónico (BBPA), un análogo muy similar (puntuación de coincidencia con BBPA = 759 (49 %)). Esto contrasta marcadamente con su homólogo PMB-PMPA para el que no se obtuvieron compuestos coincidentes al utilizar la búsqueda en la biblioteca interna del instrumento39.

Análisis GC-MS en matriz rica en ácidos grasos CW-O3 enriquecida con PMPA a una concentración de ~ 10 μg/mL. ( a ) Cromatograma de GC de la matriz CW-7-6-6-03 después de la reacción con 2,2,2-tricloroacetimidato de bencilo. No se puede observar una señal clara del producto BPMPA debido a numerosas interferencias en la matriz, incluso después de extraer iones seleccionados (m/z = 91, 186; recuadro). (b) El análisis de masas del área indicada por las líneas de puntos rojas en el recuadro de la Fig. 5a produce el espectro de masas para BPMPA.

Todos los productos químicos se compraron a proveedores comerciales y se usaron tal como se recibieron, ácido etilmetilfosfónico (EMPA), ácido ciclohexilmetilfosfónico (CMPA), ácido pinacolilmetilfosfónico (PMPA), 2,2,2-tricloroacetimidato de bencilo, 4-metoxibencil-2,2, El 2-tricloroacetimidato, el acetonitrilo (ACN), la acetona, el acetato de etilo y el diclorometano se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El bicarbonato de sodio, el carbonato de sodio y el sulfato de sodio anhidro se adquirieron de Acros Organics (Westchester, PA). El cloroformo deuterado (CDCl3) se adquirió de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). Se adquirieron filtros de jeringa de PTFE Acrodisc (0,45 µm) de Pall Laboratories (Port Washington, NY). Los viales del muestreador automático y los insertos de vidrio se adquirieron de Agilent Technologies (Santa Clara, CA.). La muestra de suelo PT-S2 y la matriz líquida CW-O3 se obtuvieron de los archivos de muestras OPCW-PT del Centro de Ciencias Forenses (FSC) en el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore (LLNL).

Se preparó una solución madre de PMPA (1 mg/mL, 1000 ppm) en DCM (10 mL) y esta solución se utilizó para enriquecer la muestra de suelo (código: PT-S2) y la muestra líquida rica en ácidos grasos ( código: CW-O3). La solución madre se mantuvo en el refrigerador (4 °C) y solo se sacó cuando se usó para diluciones o adición de las matrices. La muestra de suelo se preparó de la siguiente manera, el suelo PT-S2 (200 mg) se trató con PMPA (10 μL de solución madre, 0,01 mg) y la mezcla se convirtió en una suspensión en DCM (1 mL) y se mezcló con vórtex para asegurar una adición uniforme. muestra de suelo El DCM se evaporó con una corriente suave de nitrógeno para dar una muestra de suelo que contenía PMPA en una concentración de 5 μg/g. La muestra líquida se preparó de la siguiente manera, el CW-O3 líquido (200 μL) se diluyó con DCM (200 μL) y se trató con PMPA (40 μL de solución madre, 0,04 mg) para proporcionar una matriz líquida enriquecida con PMPA a una concentración de 10 μg. concentración /mL.

Se utilizó un GC Agilent 6890 con un detector MS 5975 equipado con un inyector split/splitless para el análisis en el modo splitless. La columna de GC utilizada para el análisis fue una columna capilar Agilent DB-5MS (30 m × 0,25 mm de diámetro interior × 0,25 μm de espesor de película). Se utilizó helio de ultra alta pureza como gas portador a 0,8 ml/min. La temperatura del inyector fue de 250 °C y el volumen de inyección fue de 1 μL. El programa de temperatura del horno fue el siguiente: 40 °C, mantenido durante 3 min, aumentado a 8 °C/min hasta 300 °C, mantenido durante 3 min. Las temperaturas de la fuente de iones MS y del cuadrupolo fueron de 230 y 150 °C, respectivamente. Se utilizó ionización electrónica con una energía de ionización de 70 eV. Se operó el MS para escanear desde m/z 29 a m/z 600 en 0,4 s. con un retardo de disolvente de 3,5 min. como se describió anteriormente28.

Los espectros se obtuvieron utilizando un instrumento Bruker Avance III de 600 MHz equipado con una criosonda Bruker TCI de 5 mm (Bruker Biospin, Billerica, MA) a 30,0 ± 0,1 °C. Se registraron RMN 1H (600 MHz), RMN 13C/13C (DEPT-135) (150 MHz) y RMN 31P/31P{1H} en CDCl3. Los datos de RMN se notifican como sigue: desplazamiento químico (δ) (partes por millón, ppm); multiplicidad: d (doblete), app diez (tentet aparente), qd (cuarteto de dobletes); las constantes de acoplamiento (J) se dan en Hertz (Hz). Los desplazamientos químicos de RMN de 1H se calibran con respecto al singlete de CHCl3 residual centrado en 7,26 ppm, mientras que para RMN de 13C se usó el triplete centrado en 77,16 ppm de CDCl3 para la calibración espectral.

Los disolventes utilizados durante las síntesis se eliminaron utilizando un evaporador rotatorio Büchi R-200 equipado con un baño calefactor Büchi B-490 y acoplado a una bomba de vacío KNF Laboport Neuberger UN820. La cromatografía de capa fina (TLC) analítica se realizó en placas de vidrio de gel de sílice de Agela Technologies junto con detección por molibdato de amonio cérico (CAM)49,50,51, exposición a vapor de yodo y/o luz ultravioleta (λ = 254 nm)52,53 ,54,55. La purificación de los estándares bencilados se realizó usando un sistema de purificación Biotage usando cartuchos de gel de sílice acoplados a un sistema de detección UV (λ = 245, 365 nm). Los análisis HRMS se obtuvieron en el Centro de Ciencias Forenses del Laboratorio Nacional Lawrence Livermore utilizando ionización química (CI). Metilfosfonato de pinacolilo de bencilo: se disolvió ácido metilfosfónico de pinacolilo (150 mg, 0,83 mmol) en DMF (5 ml) y se trató secuencialmente con carbonato de sodio (160 mg, 1,51 mmol, 1,83 equivalentes a ácido) y 2,2,2-tricloroacetimidato de bencilo (183 μL, 0,99 mmol, 1,2 equiv.). Después de agitar durante la noche, se añadió agua (5 ml) al vial de centelleo y la fase orgánica se extrajo, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se pasó a través de un disco de filtro de jeringa y se evaporó al vacío para dar un aceite amarillo que se purificó mediante una columna ultrarrápida. cromatografía (hexanos → EtOAc/hexanos 7:3) para dar metilfosfonato de pinacolilo de bencilo como un aceite incoloro (184 mg, 82%). 1H RMN (mezcla diastereoisómera: 1,5:1 (maj = mayor; min = menor, 600 MHz, CDCl3) δ 5,11 (dd, J = 11,9, 8,0 Hz, 1Hmaj), 5,06 (dd, J = 11,9, 8,1 Hz, 1Hmin ), 5,04 (dd, J = 16,9, 8,4 Hz, 1Hmaj), 5,01 (dd, J = 17,0, 8,3 Hz, 1Hmin), 4,26 (dq, J = 8,3, 6,4 Hz, 1Hmin), 4,19 (dq, J = 8,3, 6,4 Hz, 1Hmaj), 1,46 (d, J = 3,9 Hz, 3Hmin), 1,43 (d, J = 3,8 Hz, 3Hmaj), 1,26 (d, J = 6,3 Hz, 3Hmaj), 1,23 (d, J = 6,3 Hz, 3Hmin), 0,90 (s, 9Hmin), 0,89 (s, 9Hmaj), RMN 13C (150 MHz, CDCl3) δ 136,57, 136,54, 136,50, 128,48, 128,19, 127,68, 127,67, 81,36, 81.30, 81.14, 81.09 , 66,94, 66,90, 66,71, 66,68, 34,89, 34,87, 34,85, 34,83, 25,52, 25,51, 17,03, 16,86, 12,99, 12,14, 12,02, 11,17; 31P{1H} RMN (242 MHz, CDCl3) δ 30,50, 29,81, 31P RMN δ 30,49 (app diez, J = 8,4 Hz, Pmin), 29,80 (app diez, J = 8,4 Hz, Pmaj), HRMS (CI) m/z calcd para C14H23O3P [M+]: 270,1385; encontrado 270,1401. p-metoxibencilo metilfosfonato de pinacolilo: la reacción fue similar a la del homólogo de bencilo, con la única diferencia de que se usó tricloroacetimidato de p-metoxibencilo (205 μl, 0,99 mmol). El producto metilfosfonato de p-metoxibencilo pinacolilo se obtuvo como un aceite incoloro después de la purificación mediante cromatografía en columna ultrarrápida (hexanos → EtOAc/hexanos 7:3) (159 mg, 64%). RMN 1H (mezcla diastereoisómera, 600 MHz, CDCl3) δ 7,32 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 6,89 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 5,07–4,92 (m, 2Hmaj,min), 4,25 (dq , J = 8,3, 6,3 Hz, 1Hmaj), 4,18 (dq, J = 8,3, 6,3 Hz, 1Hmin), 3,80 (s, OCH3, 3Hmaj,min), 1,44 (d, J = 4,4 Hz, 3Hmaj), 1,41 ( d, J = 4,3 Hz, 3Hmin), 1,27 (d, J = 6,4 Hz, 3Hmin), 1,24 (d, J = 6,4 Hz, 3Hmaj), 0,91 (s, 9Hmaj), 0,89 (s, 9Hmin); RMN 13C (150 MHz, CDCl3) δ 159,67, 130,02, 129,64, 129,62, 128,84, 128,80, 128,74, 128,70, 113,93, 81,24, 81,19, 81,03, 80,98, 6 6,86, 66,81, 66,64, 66,60, 55,27, 34,93, 34,91, 34,89 , 34.87, 25.58, 17.07, 16.90, 13.14, 12.30; RMN 31P{1H} (242 MHz, CDCl3) δ 30,37, 29,66; RMN 31P δ 30,36 (aprox. diez, J = 8,3 Hz, Pmaj), 29,66 (aprox. diez, J = 8,3 Hz, Pmin); HRMS (CI) m/z calculado para C15H25O4P [M.+]: 300,1490; encontrado 300.1497. Los datos espectrales de estos dos estándares de PMPA bencilados se proporcionan en la Información de apoyo.

Se ha evaluado el uso de tricloroacetimidato de bencilo y p-metoxibencilo para la derivatización de marcadores de agentes nerviosos de ácido fosfónico en condiciones neutras, básicas y ligeramente ácidas. Los ácidos fosfónicos utilizados incluyeron ácido etil-, ciclohexil- y pinacolil metilfosfónico, que representan productos de hidrólisis característicos de los agentes nerviosos N-2-diisopropilaminoetilo metilfosfonotiolato de etilo (VX), ciclosarina (GF) y soman (GD) respectivamente. Las condiciones optimizadas para la derivatización de los ácidos fosfónicos incluyeron ácido neutro, básico y catalítico (< 5 mol%) con el tricloroacetimidato en exceso junto con el calentamiento de la mezcla a 60 °C en acetonitrilo durante 4 h. Los estudios comparativos demostraron que mientras la bencilación de los ácidos fosfónicos se desarrollaba sin problemas en las tres condiciones (neutras, ácidas y básicas), se descubrió que la p-metoxibencilación de estos funciona de manera eficiente solo en presencia de una base (p. ej., Na2CO3). Esto está de acuerdo con la labilidad del grupo p-metoxibencilo en condiciones de acidez suave a alta. La eficiencia del método se probó en la derivatización e identificación exitosas del ácido pinacolil metilfosfónico (PMPA) como su éster bencílico cuando estaba presente en una concentración de ~ 5 μg/g en una muestra de suelo presentada en la 44.ª OPCW-PT. Además, el protocolo se usó en la detección e identificación de PMPA cuando se añadió a una concentración de ~ 10 μg/mL en una matriz líquida rica en ácidos grasos presentada en el PT-38 de la OPAQ. El derivado de bencilo de PMPA se corroboró con la biblioteca espectral NIST interna del instrumento o la base de datos analítica central de la OPCW (OCAD v.21_2019), así como con estándares auténticos sintetizados en nuestro laboratorio. Se determinó que los valores de MDL calculados para los ácidos bencilo y p-metoxibencil pinacolil metilfosfónico eran 35 y 63 ng/g respectivamente en el extracto de suelo presentado en la 44.ª OPAQ-PT (Información complementaria).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Este trabajo fue realizado bajo los auspicios del Departamento de Energía de EE. UU. por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo el Contrato DE-AC52-07NA27344.

Centro de Ciencias Forenses, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, EE. UU.

Alagu Subramanian, José A. Rosales, Roald N. Leif & Carlos A. Valdez

División de Ciencias Nucleares y Químicas, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, EE. UU.

Alagu Subramanian, Roald N. Leif & Carlos A. Valdez

División de Biociencias y Biotecnología, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, EE. UU.

Subramaniano de Alagu

NNSA-MSIIP Summer Fellow, Universidad de Texas, El Paso, TX, EE. UU.

José A. Rosales

Dirección de Seguridad Global, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, EE. UU.

José A. Rosales, Roald N. Leif & Carlos A. Valdez

Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, 7000 East Avenue, L-090, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Carlos A. Valdez

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AS y RNL realizaron el análisis EI-GC-MS. JAR realizó la síntesis de los estándares utilizados en el proyecto y realizó los experimentos de RMN. CAV escribió el texto principal del manuscrito y preparó las figuras. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Carlos A. Valdez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Subramanian, A., Rosales, JA, Leif, RN et al. Tricloroacetimidatos de bencilo como agentes derivatizantes para ácidos fosfónicos relacionados con agentes nerviosos por EI-GC-MS durante escenarios de pruebas de competencia de la OPAQ. Informe científico 12, 21299 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25710-4

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Recibido: 14 Octubre 2022

Aceptado: 02 diciembre 2022

Publicado: 09 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25710-4

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